肖 卓，方遠(yuǎn)鵬，陳 誠(chéng)，張琳梅，唐成芳，李曉紅

(1西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，西安 710004;2西安市蓮湖新西北口腔診所;3西安醫(yī)學(xué)院口腔系口腔修復(fù)學(xué)教研室;4西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院種植中心;*通訊作者，E-mail:lixhong@xjtu.edu.cn)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是目前世界上發(fā)病率、繼發(fā)性死亡率及保健費(fèi)用消耗較大的疾病之一［1，2］。近年來(lái)隨著人口壽命的延長(zhǎng)，身處絕經(jīng)期的女性人數(shù)逐漸增加，女性絕經(jīng)后生存年限約占一生的1/3。根據(jù)我國(guó)13省市人群骨密度(bone mineral density，BMD)調(diào)查結(jié)果及1990年人口普查的數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)50歲以上的女性及74歲以上的男性患Ⅰ度以上骨質(zhì)疏松的人數(shù)約占全國(guó)總?cè)丝诘?.6%，絕經(jīng)后婦女約有30%患骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)［3］。目前較為常用的治療方法有雌激素替代治療(estrogen replacement therapy，ERT)和生長(zhǎng)激素替代治療(growth hormone replacement therapy，GHRT)以及聯(lián)合用藥［4，5］。不同于機(jī)體其他骨組織，口腔組織中剩余牙槽骨(residual ridge)是承載義齒和種植修復(fù)的關(guān)鍵，其吸收和改建更加活躍，并且受多種因素調(diào)節(jié)和影響。那對(duì)于骨質(zhì)疏松個(gè)體而言，剩余牙槽骨與軀干、四肢骨組織有何不同呢?本研究建立骨質(zhì)疏松和剩余牙槽骨動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)比不同治療方法對(duì)骨質(zhì)疏松個(gè)體其剩余牙槽骨、頜骨以及軀干和四肢骨骨密度的影響，反映骨質(zhì)疏松對(duì)剩余牙槽骨的影響。

1 材料和方法

1.1 去勢(shì)大鼠剩余牙槽骨模型建立

4月齡未交配雌性SPF大鼠65只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，為國(guó)家A級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)，體重在250－300 g之間。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同等條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。其中48只去勢(shì)組(ovariectomized rats，OVX)于1周后在全麻下手術(shù)完整切除雙側(cè)卵巢;17只為假手術(shù)組(sham-ovariectomized rats，sham-OVX)，同法切除卵巢附近大小相同的脂肪組織一塊。術(shù)后8周，兩組動(dòng)物分別隨機(jī)各取5只，處死，取股骨遠(yuǎn)心端，4%多聚甲醛固定3 d，EDTA脫鈣3周，流動(dòng)水沖洗24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作組織切片，HE染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察，并應(yīng)用醫(yī)用圖像分析儀進(jìn)行骨組織計(jì)量學(xué)分析，觀察模型建立情況。證明骨質(zhì)疏松造模成功后拔除左側(cè)上頜磨牙。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

骨質(zhì)疏松剩余牙槽骨模型建立后，所剩OVX組大鼠隨機(jī)分為4組:OVX組、雌激素治療組(estrogen replacement therapy，ERT)、生長(zhǎng)激素治療組(rhGH therapy，rhGHT)、雌激素生長(zhǎng)激素聯(lián)合治療組(estrogen and rhGH therapy，ErhGHT)。每組10只大鼠(OVX組死亡3只)。拔牙術(shù)后3 d開(kāi)始背部皮下注射給藥:ERT組皮下注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/kg，上海第九制藥廠)，1次/3 d;rhGHT組皮下注射重組人生長(zhǎng)激素(0.15 IU/kg)，1次/d;ErhGHT組皮下注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/kg)，1次/3 d，重組人生長(zhǎng)激素(0.15 IU/kg)，1次/d;OVX組和sham-OVX組注射等計(jì)量生理鹽水，1次/d。

1.3 標(biāo)本制備

去卵巢后8周，OVX組動(dòng)物和sham-OVX組動(dòng)物分別隨機(jī)各取5只，采用過(guò)量乙醚麻醉處死，取股骨遠(yuǎn)心端，多聚甲醛固定3 d，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，醫(yī)用圖像分析儀進(jìn)行骨組織計(jì)量學(xué)分析，觀察模型建立情況。拔牙術(shù)后4周時(shí)，每組隨機(jī)取5只大鼠，全麻，采血后處死;取大鼠完整上頜骨，剩余牙槽嵴側(cè)和頜骨側(cè)，40 g/L多聚甲醛固定3 d，雙能X線測(cè)定BMD;取大鼠右側(cè)股骨及腰椎，處理同上;術(shù)后8周時(shí)，處死剩余大鼠，處理同上。

1.4 結(jié)果判定

使用醫(yī)用圖像處理與分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織計(jì)量學(xué)測(cè)定，計(jì)算骨小梁平均寬度(Trabecular Width，Tb.Wi，μm)、骨小梁平均間隔寬度(Trabecular Separation，Tb.Sp，μm)和骨小梁面積/視野面積百分比(Trabecular area.Tb.Ar，%)，每張切片選擇10 個(gè)視野。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果以±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。各組組間比較采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為顯著相關(guān)。

圖1 拔牙8周后sham-OVX組和OVX組HE染色情況Figure 1 Histological changes of femur after 8 weeks in sham-OVX and OVX rats by HE staining

2 結(jié)果

2.1 建模成功指標(biāo)

光鏡下觀察sham-OVX組大鼠骨小梁密集，排列成網(wǎng)狀，連續(xù)無(wú)斷裂，表面光滑，少見(jiàn)破骨細(xì)胞，骨小梁間距正常。而OVX組大鼠骨小梁數(shù)量減少，較細(xì)，排列無(wú)規(guī)則稀疏，有斷裂，表面可見(jiàn)較多破骨細(xì)胞和骨吸收，小梁間距增寬，骨髓腔增大(圖1，見(jiàn)第1002頁(yè))。從表1可見(jiàn)，OVX組大鼠骨小梁間距明顯高于sham-OVX組，OVX組股骨骨小梁寬度、骨小梁面積/視野面積百分比明顯低于sham-OVX組(P＜0.05)。

2.2 給藥4周和8周時(shí)BMD的變化

所有骨組織標(biāo)本中3個(gè)治療組(rhGHT、ERT和ErhGHT)給藥8周時(shí)，BMD均較給藥4周時(shí)升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05，見(jiàn)表2)。給藥4周時(shí)，各組間比較單因素方差分析結(jié)果顯示:雖然3個(gè)治療組BMD低于sham-OVX組，但是其BMD已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于OVX組，且其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而給藥 8周時(shí)，3個(gè)治療組 BMD與sham-OVX組相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與OVX組比較，差異更加顯著。

表1 建模術(shù)后8周時(shí)OVX組及sham-OVX組股骨組織切片骨計(jì)量學(xué)分析(±s，n=5)Table 1 Comparison of bone histomorphometry of femur tissues between OVX and sham-OVX rats at 8 week after surgery(±s，n=5)

表1 建模術(shù)后8周時(shí)OVX組及sham-OVX組股骨組織切片骨計(jì)量學(xué)分析(±s，n=5)Table 1 Comparison of bone histomorphometry of femur tissues between OVX and sham-OVX rats at 8 week after surgery(±s，n=5)

與 sham-OVX 組比較，*P＜0.05

OVX 組 28.67±6.90*103.72±19.06* 16.45±7.52*

2.3 相關(guān)性分析

上頜剩余牙槽骨與股骨(r=0.976，P=0.004)，上頜剩余牙槽骨與腰椎去勢(shì)后的骨量變化呈正相關(guān)(r=0.942，P=0.017)。上頜骨與股骨(r=0.973，P=0.005)，上頜骨與腰椎去勢(shì)后的骨量變化均呈正相關(guān)(r=0.936，P=0.019)。

表2 用藥后4周及8周各組大鼠上頜骨、腰椎、股骨和剩余牙槽骨BMD的比較(g/cm2，±s)Table 2 Comparison of BMD in maxillary，lumbar spine，femur and residual bone at 4 and 8 weeks after medication(g/cm2，±s)

表2 用藥后4周及8周各組大鼠上頜骨、腰椎、股骨和剩余牙槽骨BMD的比較(g/cm2，±s)Table 2 Comparison of BMD in maxillary，lumbar spine，femur and residual bone at 4 and 8 weeks after medication(g/cm2，±s)

同組與給藥4周時(shí)相比，*P＜0.05;同時(shí)間與OVX組相比，#P＜0.05

槽骨周 0.083 6±0.003 00.082 7±0.002 10.083 9±0.003 4

3 討論

大鼠雌激素缺乏后的骨代謝改變與人類最為接近，本研究采用去勢(shì)大鼠作為骨質(zhì)疏松模型［6］。1995年，美國(guó)FDA推薦去勢(shì)大鼠為最適合模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松藥物治療的動(dòng)物模型［7］。大鼠的自然壽命為2－3年，性成熟期2－3個(gè)月;在觀察大鼠骨骼發(fā)育規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，3－6月齡大鼠處于骨骼緩慢增長(zhǎng)階段，變化較小，6－12月齡時(shí)骨密度與骨鈣含量變化最小，到12月齡時(shí)骨代謝檢測(cè)指標(biāo)達(dá)到峰值水平，24月齡后出現(xiàn)自發(fā)性骨丟失［8］。基于以上研究結(jié)果，本試驗(yàn)選用了4月齡雌性成年SD大鼠來(lái)建立PMO模型。骨計(jì)量學(xué)研究證實(shí)OVX組大鼠骨小梁間距明顯高于sham-OVX組，OVX組股骨骨小梁寬度、骨小梁面積/視野面積百分比明顯低于sham-OVX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，證實(shí)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型建立成功。

骨質(zhì)疏松癥在早期并無(wú)臨床癥狀和體征，患者也無(wú)任何不適感覺(jué)，被稱為“靜悄悄的疾病”。然而到了中晚期則出現(xiàn)疼痛，身高變矮、駝背，骨折甚至呼吸障礙等。早期發(fā)現(xiàn)并診斷骨質(zhì)疏松癥，避免這些癥狀的出現(xiàn)是極為重要的。停經(jīng)以后，血漿中雌激素水平下降，BRU不斷被激活，激活頻率大大提高，骨轉(zhuǎn)換增加;每個(gè)完整的周期內(nèi)骨形成的時(shí)間遠(yuǎn)大于骨吸收的時(shí)間。骨轉(zhuǎn)換的增加使得骨丟失的速度增加，這就是高轉(zhuǎn)換型的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松形成的根本原因，也是絕經(jīng)婦女骨量快速丟失的根本原因。本實(shí)驗(yàn)中剩余牙槽骨、頜骨、腰椎、股骨OVX組的BMD低于sham-OVX組，說(shuō)明去勢(shì)后由于雌激素缺乏，骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)，骨丟失加快，骨量減少。同時(shí)剩余牙槽骨、頜骨BMD減低與腰椎、股骨BMD變化正相關(guān)，表明剩余牙槽骨、頜骨作為全身骨的一部分，去勢(shì)后剩余牙槽骨、頜骨也出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松。這與Gilles等［9］認(rèn)為雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致口腔骨量喪失的研究結(jié)果一致。Elovic在下頜三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)和下頜磨牙拔除對(duì)下頜骨骨強(qiáng)度降低有協(xié)同作用，去勢(shì)后下頜磨牙拔除使下頜骨強(qiáng)度下降25%，但在假手術(shù)組未見(jiàn)同樣改變［10］。本實(shí)驗(yàn)中sham-OVX組頜骨BMD高于剩余牙槽骨，sham-OVX組剩余牙槽骨BMD高于OVX組，提示絕經(jīng)期婦女剩余牙槽骨骨密度受全身致病因素雌激素水平降低和局部致病因素牙齒拔除的雙重影響。牙槽骨的主要作用是支持牙齒承受由牙周膜傳遞而來(lái)的力，并將力廣泛分散于支持組織內(nèi)。牙槽骨的骨質(zhì)疏松使骨的承受力的能力降低，影響修復(fù)效果。因此對(duì)于處于絕經(jīng)期的婦女，牙齒拔除后剩余牙槽骨和頜骨骨質(zhì)量的控制對(duì)于缺失牙的修復(fù)有重要意義。

卵巢功能減退、內(nèi)分泌失調(diào)、雌激素不足是絕經(jīng)前后生理及器官功能失調(diào)的基本病因［11］，補(bǔ)充雌激素是緩解這些問(wèn)題的病因性治療，因此是首選療法［12］。Gallagher等［13］研究了應(yīng)用小劑量雌激素對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治作用，對(duì)218名絕經(jīng)后婦女的研究中發(fā)現(xiàn)，小劑量HRT組比對(duì)照組明顯增加了全身骨的BMD。HRT對(duì)老年人和已經(jīng)發(fā)生了骨質(zhì)疏松的婦女依然有效。同樣，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素對(duì)骨代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。絕經(jīng)后婦女GH降低顯著，骨質(zhì)疏松加重;而通過(guò)GH治療骨質(zhì)疏松有明顯改善［14］。本研究即采用了GH和雌激素單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥的給藥途徑來(lái)評(píng)估其對(duì)剩余牙槽骨的影響。在本研究中，給藥4周時(shí)，rhGHT組、ERT組、ErhGHT組BMD低于sham-OVX組且存在顯著性差異，可能是治療時(shí)間較短，骨重建的周期還未完成，骨量增加不足的結(jié)果;ErhGHT高于rhGHT組，ERT組，但無(wú)顯著性差異，可能是由于同時(shí)應(yīng)用了激活骨形成和抑制骨吸收的藥物，在抑制破骨的同時(shí)成骨也得到增強(qiáng)，大量的骨單位進(jìn)入骨重建空間，進(jìn)行骨重建，骨吸收被抑制，骨吸收的程度得到減低，骨重建的速度被加快，骨量增加的速度稍快。而給藥8周時(shí)，rhGHT組、ERT組、ErhGHT組BMD均增加至sham-OVX組水平。表明骨密度的增加與治療時(shí)間有密切關(guān)系，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，BMD逐漸達(dá)到正常水平，提示骨量增加受時(shí)間影響，治療的時(shí)間應(yīng)該與骨重建完成一個(gè)周期的時(shí)間相適應(yīng)，不少于8周，才能獲得穩(wěn)定的骨量。

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