黃 河，韓高華，徐千明，王松華，郭 婷，程國昌

(1泰州市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，泰州 225300;2泰州市人民醫(yī)院普通外科;*通訊作者，E-mail:chengguochang@126.com)

放射治療是食管癌綜合治療的主要手段之一，約50%－60%的患者在患病過程中會接受放射治療。而臨床工作中，我們注意到有些病理類型甚至臨床分期相同的患者，給予相同放射治療后，近期療效和預(yù)后并不一致，放射治療反應(yīng)差異明顯［1］。這種個體間放療反應(yīng)差異與遺傳變異有關(guān)［2，3］。腫瘤患者自身基因狀態(tài)如DNA損傷修復(fù)基因(XRCC、APE1、ERCC 等)近年來倍受關(guān)注［4］。本研究選取150例接受單一放療方案的初治食管癌患者為研究對象，檢測其外周血DNA修復(fù)基因(XRCC1、APE1單核苷酸多態(tài)性)的分布情況，同時比較其與食管癌放射治療敏感性的關(guān)系，以期尋找一種能夠預(yù)測食管癌放療敏感性的可靠指標(biāo)，指導(dǎo)臨床合理治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取150例2010－04～2012－08在我院接受單行放療的初治食管鱗癌患者。年齡32－82歲，平均(64±10)歲，均為漢族人。接受放射治療前，無肺、肝等遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，無肝腎等器官功能障礙，一般情況良好。

1.2 放療方法及療效評價

三維適形放療，常規(guī)分割2.0 Gy/次、近似劑量60－66 Gy/30－33次，放療結(jié)束3個月后復(fù)查食管鋇透、胸部CT及腫瘤標(biāo)志物。RECIST標(biāo)準(zhǔn)判斷近期療效［5］。完全緩解(CR):食管鋇餐提示原發(fā)腫瘤病灶消失，食管壁柔軟，鋇劑順利通過，胸部CT掃描食管壁厚度小于5 mm，原腫大淋巴結(jié)消失，沒有新發(fā)病灶出現(xiàn);部分緩解(PR):食管鋇餐、胸部CT掃描測量食管原發(fā)病灶基線最長徑減少≥30%;疾病穩(wěn)定(SD):根據(jù)食管鋇餐、胸部CT掃描測量食管原發(fā)病灶基線減少未達(dá)到PR，或者增大未達(dá)到PD;疾病進展(PD):根據(jù)食管鋇餐、胸部CT掃描測量得食管原發(fā)病灶基線最長徑總和增大≥20%，或出現(xiàn)一個或多個新發(fā)病灶。CR+PR為放療有效組，SD+PD為放療無效組。

1.3 DNA提取和基因型分析

放療前留取靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸鈉抗凝采血管留存待檢。用苯酚－氯仿法抽提白細(xì)胞DNA，－20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。以限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR－RFLP)方法進行XRCC1和APE1基因型分析。XRCC1的引物為:上游 5’－TCTCCCTTGGTCTCCAACCT－3’和下游5’－AGTAGTCTGCTGGCTCTGG－3’，產(chǎn)物大小為402 bp;APE1的引物為:上游5’－CTGTTTCATTTCTATAGGCTA－3’和下游 5’－AGGAACTTGCGAAAGGCTTC－3’，產(chǎn)物大小為164 bp。30μl體系，反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s、62.3℃ 30 s和72℃ 1 min進行30個循環(huán)，72℃延伸7 min。分別取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物與限制性核酸內(nèi)切酶MspⅠ或BfaⅠ于37℃孵育過夜，3%瓊脂糖凝膠電泳，GDS－8000凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳圖譜，判斷各基因型。

第399密碼子Arg/Gln突變后可被MspⅠ識別，酶切產(chǎn)物有269 bp和133 bp兩個片段;雜合子則產(chǎn)生402 bp、269 bp、133 bp三個片段;而野生型只有402 bp一個片段。第148密碼子Asp1/Glu突變后可被BfaⅠ識別，酶切產(chǎn)物有144 bp和20 bp兩個片段;雜合子則產(chǎn)生164 bp、144 bp、20 bp三個片段;而野生型只有164 bp一個片段。我們同時采用直接測序的方式進行驗證，確保引物分型準(zhǔn)確。測序結(jié)果證實，引物擴增片段與預(yù)期符合，與PCRRFLP分型法一致。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件進行，卡方檢驗分析XRCC1、APE1不同基因型之間放射治療的療效差異;非條件logistic回歸模型計算OR值和95%CI，同時經(jīng)患者年齡、性別、組織類型、臨床分期等指標(biāo)校正。雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 放療效果

150例食管鱗癌患者經(jīng)根治性三維適形或調(diào)強放療，有效125例，占83.3%;無效25例，占16.7%。不同年齡、性別、病理分化程度、臨床分期患者間放療有效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。

表1 食管癌放療患者臨床病理參數(shù)及療效比較 例(%)Table 1 Comparison of clinicopathological parameters and clinical efficacy between radiosensitive group and radioresistant group cases(%)

2.2 基因型分布

本研究150例食管鱗癌患者中，攜帶 APE1 148Asp/Glu基因型者97例，占64.7%;53例攜帶Asp/Asp基因型，占35.3%;Glu/Glu突變純合子未檢測到。攜帶 XRCC1 399 Arg/Arg基因型32例(21.3%)，攜帶 Arg/Gln 基因型 43 例(28.7%)，攜帶Gln/Gln基因75例(50.0%)。以上多態(tài)性位點各等位基因分布符合Hardy－Weinberg平衡，該人群具有代表性。

2.3 基因多態(tài)性與化療效果

XRCC1 399 Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln 基因型患者放射治療有效率分別為 59.4%，88.4%和90.7%;三種基因型放療效率差異有統(tǒng)計學(xué)價值(P=0.010＜0.05)。XRCC1 399 Gln/Gln基因型患者放療有效率是 Arg/Arg基因型患者的6.967倍(95%CI 1.849－27.917，P=0.016)。

Arg/Arg基因型攜帶患者與至少一個Gln等位基因攜帶患者放療有效率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。攜帶APE1 Asp/Glu基因型患者放療有效率為 87.6%，高于Asp/Asp基因型患者(75.5%);其放療有效率是攜帶Asp/Glu基因型患者的 2.451 倍(95%CI:0.806－7.564)，差異無統(tǒng)計學(xué)價值(P=0.115)。APE1突變純合型(Glu/Glu)本研究中未檢測到(見表2)。

表2 XRCC1、APE1基因型與食管癌近期療效關(guān)系 例(%)Table 2 Relationship between XRCC1，APE1 genotype and short-term efficacy in patients with esophageal cancer cases(%)

為進一步分析APE1和XRCC1基因的內(nèi)在聯(lián)系，我們比較了 APE1 Asp194Glu與 XRCC1 Arg399Gln兩個位點基因型聯(lián)合表達(dá)情況與放療敏感性的關(guān)系。結(jié)果表明，同時攜帶APE1 194Asp/Glu和XRCC1 399Gln/Gln基因型的患者，其放療有效率最高(達(dá)67.8%)，明顯高于攜帶其他基因型患者的療效(P=0.02＜0.05)。

3 討論

中國食管癌發(fā)病率和死亡人數(shù)最高，占全球食管癌發(fā)病和死亡人數(shù)的53.86%和49.26%。食管癌死亡率在我國位于十大惡性腫瘤的第四位［6］。多數(shù)患者就診時已屬中晚期，喪失手術(shù)機會，放射治療占有重要地位。臨床上我們發(fā)現(xiàn)病理類型和臨床分期均相同的患者，采用同樣的放療方案，其療效有一定的差異。如果在治療前能預(yù)測到這種放療敏感性的差異，就可以制定個體化的放療方案，提高治愈率。因此，依據(jù)遺傳學(xué)特征選擇合理的個體化治療方案是目前食管癌治療的熱點問題之一［7］。

高能射線作用于細(xì)胞DNA，或直接損傷DNA分子鏈，引起DNA的單鏈、雙鏈斷裂;或通過OH－自由基對DNA分子鏈的作用，間接引起DNA分子鏈結(jié)構(gòu)和功能的損傷，使轉(zhuǎn)錄、復(fù)制停止，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，留待修復(fù)，無法修復(fù)的細(xì)胞將死亡。顯然，DNA損傷修復(fù)的能力就決定了腫瘤對輻射的敏感性。因此，具有DNA損傷修復(fù)作用的類X射線交錯互補修復(fù)基因1(XRCC1)及脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE1)基因成為受人關(guān)注的候選基因。

XRCC1基因參與離子輻射和化學(xué)誘變劑所致DNA損傷后的單鏈斷裂修復(fù)和堿基切除修復(fù)，是重要的DNA修復(fù)基因［8］。XRCC1能通過自身的不同部位與多種堿基切除修復(fù)相關(guān)蛋白(如 DNA聚合酶β、PARP1等)結(jié)合并發(fā)生相互作用，促進對DNA損傷修復(fù)，對維持基因組的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用，并參與DDP或 CBP引起的 DNA損傷修復(fù)過程。文獻報道主要是Arg399Gln位點的多態(tài)性改變與細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)能力有關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)XRCC1 Arg399Gln多態(tài)性與食管鱗狀細(xì)胞癌放療反應(yīng)密切相關(guān)，Gln/Gln、Arg/Gln、Arg/Arg基因型患者放療有效率分別為 90.7%，88.4% 和 59.4%;XRCC1 399Gln/Gln基因型患者放療有效率是Arg/Arg基因型患者的6.967倍(95%CI1.849－27.917，P=0.016)。攜帶Arg/Arg基因型患者與攜帶至少一個Gln等位基因患者放療有效率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。我們推測XRCC1 28152位點核苷酸G→A轉(zhuǎn)換引起編碼的精氨酸(Arg)變成了谷氨酰胺(Gln)，從而抑制了XRCC1蛋白的功能，進而減弱了DNA的修復(fù)能力，從而使患者對放療具有更好的反應(yīng)性。Chang-Claude等［10］進行了乳腺癌放療敏感病例與非敏感病例的對比研究，發(fā)現(xiàn)放射敏感病例XRCC1 399位點的Gln的比例明顯高于不敏感者。Cometta等［11］利用X線(2 Gy)照射健康人外周血細(xì)胞后立即采用慧星分析，同時測定XRCCl的基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶399Gln/Gln純合子的慧星尾部長于野生型和雜合型，體現(xiàn)其放射敏感性強于其他基因型。這些都進一步印證了我們的結(jié)論。此外，不同人群的遺傳背景也可能會影響研究結(jié)果。張旭升等［12］針對新疆地區(qū)食管鱗癌患者的研究與我們的結(jié)論相反。他們發(fā)現(xiàn)攜帶Arg/Arg基因型的患者對放療更為敏感。這提示研究對象的異質(zhì)性也會影響SNP放療效果。

APE1是BER通路的限速酶，對維護DNA修復(fù)起關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)修復(fù)氧化性損傷所導(dǎo)致的DNA脫嘌呤/脫嘧啶(AP)位點［13］。APE1基因最常見的多態(tài)性位點是T1349G(Asp148Glu)，該位點突變會導(dǎo)致染色體損傷頻率增加，減低DNA修復(fù)能力。不少研究發(fā)現(xiàn)APE1 T1349G多態(tài)性能改變腫瘤發(fā)生風(fēng)險［14，15］，但本研究僅發(fā)現(xiàn)同時攜帶 APE1 194Asp/Glu和XRCC1 399Gln/Gln基因型的患者，其放療有效率最高，達(dá)67.8%，明顯高于攜帶其他基因型患者的療效;并未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與食管癌放療敏感性直接相關(guān)。

總之，本研究顯示，XRCC1基因多態(tài)性與食管癌患者放療近期療效明顯有關(guān)，APE1基因多態(tài)性可能與XRCC1有聯(lián)合協(xié)同作用。外周血標(biāo)本檢測SNP簡便易行，但是需要后續(xù)大樣本前瞻性研究進一步證實XRCC1和APE1基因多態(tài)性的預(yù)測價值，我們有望利用XRCC1和APE1 SNP情況預(yù)測食管癌患者放射治療療效，從而更好地指導(dǎo)個體化治療。

［1］ChiCW，Chen CC，Chen YJ.Therapeutic and radiosensitizing effects of armillaridin on human esophageal cancer cells［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，4(5):92－97.

［2］Yang C，Wang Y，Zhang F，etal.Inhibiting UHRF1 expression enhances radiosensitivity in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Mol Biol Rep，2013，40(9):5225－5235.

［3］Qian D，Zhang B，He LR，etal.The telomere/telomerase binding factor PinX1 is a new target to improve the radiotherapy effect of oesophageal squamous cell carcinomas［J］.J Pathol，2013，229(5):765－774.

［4］Yao Y，Shi J，Zhang Z，etal.The radiation－sensitizing effect of flavopiridol in the esophageal cancer cell line Eca109［J］.Oncol Lett，2013，5(6):1872－1876.

［5］You Y，Liu J，Wang Z，etal.The enhancement of radiosensitivity in human esophageal squamous cell carcinoma cells by zoledronic acid and its potential mechanism［J］.Cytotechnology，2013，19(3):112－123.

［6］Enzinger PC，Mayer RJ.Esophageal cancer［J］.N Engl J Med，2003，49:2241－2252.

［7］Rousseau D，Capitain O，Denis F，etal.Esophageal cancer:outcome according to therapeutic strategy［J］.Cancer Radiother，2013，17(1):10－20.

［8］Yoon HH，Gibson MK.Combined－modality therapy for esophageal and gastroesophageal junction cancers［J］.Curr Oncol Rep，2007，9:184－192.

［9］Wang Y，Spitz MR，Lee JJ，etal.Nucleotide excision repair pathway genes and oral premalignant lesions［J］.Clin Cancer Res，2007，13:3753－3758.

［10］Chang－Claude J，Ambrosone CB，Lilla C，etal.Genetic polymorphisms in DNA repair anddamage response genes and late normal tissue complications of radiotherapy for breast cancer［J］.BrJ Cancer，2009，100:1680－1686.

［11］Cometta T，F(xiàn)esta F，Testa A，etal.DNA damage repair and genetic Polymorphisms:Assessment of individual sensitivity and repair capacity［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2006，66(2):537－545.

［12］張旭升，阿合力，那斯肉拉，等.hOGG1、XRCC1、XRCC3單核苷酸多態(tài)性與食管癌放射敏感性的相關(guān)性研究［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，33(5):473－481.

［13］Fareed KR，Al－Attar A，Soomro IN，etal.Tumour regression and ERCC1 nuclear protein expression predict clinical outcome in patients with gastro-oesophageal cancer treated with neoadjuvant chemotherapy［J］.Br J Cancer，2010，102(11):1600－1607.

［14］Tse D，Zhai R，Zhou W，etal.Polymorphisms of the NER pathway genes，ERCC1 and XPD are associated with esophageal adenocarcinoma risk［J］.Cancer Causes Control，2008，19(10):1077－1083.

［15］Al-Attar A，Gossage L，F(xiàn)areed KR，etal.Human apurinic/apyrimidinic endonuclease(APE1)is a prognostic factor in ovarian，gastro－oesophageal and pancreatico－biliary cancers［J］.Br J Cancer，2010，102(4):704－709.