張 靜，王亭忠，魏 峰，倪雅娟，馬愛群*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心臟中心，烏魯木齊 830000;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科;3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者，E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)

通過MSCs移植修復(fù)或替代嚴(yán)重受損或壞死的心肌細(xì)胞來改善缺血性心臟病心臟功能、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)已成為目前的研究熱點(diǎn)［1］。大量動物實(shí)驗(yàn)［2－4］表明，心肌梗死區(qū)域 MSCs的局部移植可向心肌細(xì)胞分化，但也有研究［2］觀察到心肌梗死患者接受MSCs移植后會發(fā)生心律失常。心律失常的發(fā)生發(fā)展與心肌上離子通道的分化表達(dá)有重要關(guān)系，鈉離子通道對心肌細(xì)胞動作電位的產(chǎn)生、傳導(dǎo)和維持動作電位時程等起到重要作用。其中，Nav1.5是鈉離子通道孔形成的亞基單位，在心電活動中發(fā)揮重要作用［5］。該研究擬觀察同種異體的MSCs移植到大鼠體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境后Nav1.5的表達(dá)情況，為移植后心律失常發(fā)生的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

80 g清潔級雄性SD大鼠1只，用于骨髓供體;180－200 g清潔級雄性SD大鼠50只，用于建立MI模型，均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 儀器及試劑

BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購于成都泰盟科技有限公司，HM325石蠟切片機(jī)購于德國MICROM公司，激光顯微切割儀購于瑞士LEICA公司，BX51型正置光學(xué)顯微鏡購于日本Olympus公司，水合氯醛購于西安化學(xué)試劑廠，兔抗大鼠Nav1.5抗體購于美國Santa cruz公司，山羊抗兔IgG-Cy3購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MSCs的分離、標(biāo)記及貼壁培養(yǎng) 采用Percoll’s密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化SD大鼠 MSCs，采用文獻(xiàn)［6］的方法，以攜帶 GFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染標(biāo)記，將GFP標(biāo)記的MSCs懸液以5×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，放在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。24h后更換培養(yǎng)基，加入新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，每3－4 d換液一次，直到細(xì)胞占瓶底的80%或接近融合時，用0.25%的胰蛋白酶消化，直到細(xì)胞回縮成圓形，倒掉胰蛋白酶，向培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)基，吸管吹打，待細(xì)胞從瓶壁上脫落后，平分為兩瓶，各加入新鮮的10%FBS，完成傳代培養(yǎng)。

1.3.2 MI模型的建立 100 g/L水合氯醛以3 ml/kg的劑量通過腹腔注射麻醉健康成年SD大鼠(n=50)，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，剪開皮膚，鈍性分離胸大肌和前鋸肌，用血管彎鉗穿透肋間肌進(jìn)入胸腔并沿肋間隙方向撐開，另一血管彎鉗沿垂直肋間隙方向撐開肋骨，適當(dāng)用力將心臟擠出，迅速在左心耳與肺動脈圓錐交界處平左心耳下緣2 mm處，以7/0無損傷縫合線結(jié)扎LAD近端，結(jié)扎后立即將心臟歸位并置入接注射器的引流管，對合皮膚的同時抽出胸腔內(nèi)氣體約2 ml維持胸腔負(fù)壓，立即拔管并行胸外按壓，體表心電圖觀察有無急性心肌梗死后ST段抬高的心電圖改變，待心率、心律及呼吸正常且平穩(wěn)后，縫合皮膚，術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素鈉。

1.3.3 GFP標(biāo)記的MSCs的體內(nèi)移植 將成功建立MI模型的42只大鼠2周后接受MSCs移植，采用建立MI模型的同樣方法麻醉、開胸、暴露心臟，用1 ml胰島素注射器于心肌梗死局部發(fā)白區(qū)即MI周邊區(qū)圓周分布均勻迅速注射6×106個MSCs(約0.15 ml細(xì)胞懸液)，注射后的心臟歸位等步驟同MI模型的建立。

1.3.4 心肌組織標(biāo)本的提取 將再次成功建立移植模型的34只大鼠于移植后第3，5，7，9天分別隨機(jī)處死 10，10，10，4 只。第 3，5，7 天處死的 10 只中，5只用于免疫熒光染色，5只用于Real-time PCR法檢測，第9天處死的4只，用于TUNEL凋亡染色。

1.3.5 免疫熒光染色將第3，5，7天處死的大鼠心臟取出，沖洗，取注射部位的心肌組織，40 g/L多聚甲醛固定，200 ml/L蔗糖溶液脫水，OCT包埋，冰凍，連續(xù)組織切片，行常規(guī)免疫熒光染色;一抗?jié)舛葹橥每勾笫驨av1.5(1∶100)，二抗?jié)舛葹镃y3標(biāo)記的山羊抗兔(1∶100);激光共聚焦顯微鏡觀察其結(jié)果。

1.3.6 real-time PCR 檢測 同 1.3.5 中方法取出心臟，取注射部位的心肌組織，制備組織切片，方法同免疫熒光染色。應(yīng)用激光顯微切割儀捕獲切片上GFP標(biāo)記的MSCs，消化酶消化未移植的MSCs及各時間點(diǎn)的RNA，并行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為25℃，10 min;50℃，20 min;85℃，5 min;real time-PCR反應(yīng)條件為50℃，2 min;95℃，2 min;95℃，15 s;60℃，30 s，5個循環(huán)，內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。采用2－ΔΔCt的方法分別計算其相對表達(dá)量。

1.3.7 TUNEL 凋亡染色 處死9 d 的大鼠，同1.3.5中方法取出心臟，取注射部位的心肌組織，方法同免疫熒光染色，將組織吸附到用多聚賴氨酸處理過的載玻片上制備組織切片;添加20μg/ml蛋白酶K稀釋液，室溫孵育;再次固定，滴入Equilibration緩沖液后滴加rTdT反應(yīng)混合物同時覆蓋塑料蓋膜，37℃濕盒中孵育;避光環(huán)境下加入Streptavidin HRP稀釋液，室溫孵育，PBS沖洗后加入DAB稀釋液，室溫干燥;熒光顯微鏡結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GFP標(biāo)記的MSCs的貼壁培養(yǎng)與標(biāo)記

GFP標(biāo)記的MSCs呈成纖維細(xì)胞樣的長梭形，貼壁生長，分布均勻，增殖速度較快(見圖1)。

圖1 GFP標(biāo)記的MSCs的貼壁培養(yǎng) (×600)Figure 1 Adherent culture of GFP-labeled MSCs(×600)

圖2 體內(nèi)移植的GFP標(biāo)記的MSCs及其免疫熒光染色(×600)Figure 2 The transplanted GFP-labeled MSCs in vivo and their immunofluorescence staining(×600)

2.2 移植的MSCs局部分布特點(diǎn)及Nav1.5的免疫熒光染色

通過免疫熒光顯微鏡觀察移植的GFP標(biāo)記的MSCs，在心肌組織內(nèi)排列方向與心肌細(xì)胞一致，呈帶狀分布(圖2A，見第1001頁)，通過Nav1.5的免疫熒光染色觀察到于移植后3，5，7 d均無Nav1.5的表達(dá)(見圖2B，見第1001頁)。

2.3 GFP標(biāo)記的MSCs移植前后mRNA的表達(dá)

移植的MSCs上 Nav1.5 在移植后3，5，7 d之間比較及與未移植的MSCs相比，其相對表達(dá)量均無明顯變化(P＞0.05，見圖3)。

圖3 GFP標(biāo)記的 MSCs移植前后 Nav1.5 mRNA相對表達(dá)量Figure 3 Relative expression of Nav1.5 mRNA before and after transplantation

圖4 移植的MSCs的TUNEL凋亡染色(×200)Figure 4 TUNEL staining of the transplanted MSCs(×200)

2.4 TUNEL 凋亡染色

移植的MSCs數(shù)量逐漸減少，移植后9 d，MSCs細(xì)胞數(shù)量明顯減少，移植區(qū)域行TUNEL凋亡染色示移植區(qū)域的GFP標(biāo)記的MSCs在光鏡下呈棕褐色(圖4，箭頭所示，見第1001頁)。

3 討論

MSCs已成為移植領(lǐng)域的熱點(diǎn)細(xì)胞［7］，大量的動物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)已證實(shí)MSCs的移植可以修復(fù)壞死的心肌細(xì)胞從而改善心臟功能。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植的MSCs的分化具備環(huán)境誘導(dǎo)依賴性［8］。移植的MSCs所處環(huán)境是病態(tài)環(huán)境，周圍既有正常的心肌細(xì)胞，也有受損或異常的心肌細(xì)胞以及纖維瘢痕組織等，MSCs具有多向分化潛能，是否能夠向正常心肌細(xì)胞分化而具有正常心肌細(xì)胞的電生理特性有待證實(shí)。

電壓門控型鈉離子通道是維持心肌細(xì)胞電活動的主要離子通道之一，包括α和β兩個亞基［9］。其中，Nav1.5是鈉通道家族成員之一，是鈉通道的主要α亞基，具有鈉通道主要電生理特性，新近研究已證實(shí)許多心律失常的發(fā)生是由于Nav1.5不能正常分化表達(dá)而致心肌傳導(dǎo)功能障礙所引起［10］，如先天性或獲得性長QT綜合征、Brugada綜合征、擴(kuò)張性心肌病、病態(tài)竇房結(jié)綜合征、心房顫動、心肌傳導(dǎo)功能障礙及嬰兒猝死綜合征等［11，12］。影響 Nav1.5分化表達(dá)的因素不單是離子通道本身，還包括其相互作用蛋白，通過復(fù)雜的分子和細(xì)胞學(xué)機(jī)制精確調(diào)節(jié)Nav1.5表達(dá)和生物學(xué)功能而影響其電生理特性［13］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植的MSCs在體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境中不表達(dá)Nav1.5，其表達(dá)缺失是由于離子通道本身還是其相互作用蛋白的缺失所致尚不明確。本實(shí)驗(yàn)小組前期研究結(jié)果表明移植的MSCs在體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境中可以表達(dá)cTnI、MYH、Cx43等心肌特異性標(biāo)志物，說明移植的MSCs在形態(tài)學(xué)上朝心肌細(xì)胞方向分化，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示移植的MSCs不能獲得正常心肌細(xì)胞的鈉離子通道的電生理特性，這可能會增加移植細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞間電生理偶聯(lián)的異質(zhì)性，會引起心電活動的異常，從而導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)同時觀察到隨著移植時間的延長，移植的MSCs細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，證實(shí)其在心肌缺血微環(huán)境中發(fā)生了凋亡，有動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSCs移植后24 h，50%以上的移植細(xì)胞發(fā)生了凋亡，1周后超過90%的移植細(xì)胞發(fā)生了凋亡［14］，推測微環(huán)境可能是影響MSCs凋亡的主要因素，其具體機(jī)制尚不明確，可能與移植區(qū)域周邊心肌細(xì)胞因壞死而產(chǎn)生肌纖維的斷裂、細(xì)胞間網(wǎng)格結(jié)構(gòu)破壞及在微環(huán)境中缺乏足夠的營養(yǎng)能量供給等相關(guān)，局部注射的移植方法本身也可能使移植區(qū)域細(xì)胞分布不均勻，引起周圍炎癥細(xì)胞聚集發(fā)生急性炎癥反應(yīng)致使移植細(xì)胞凋亡，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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