陳 娜 楊 毅 張 瀾 方劍火 郎繼東 曹 云 田 埂，3

腸道菌群履行著重要的功能，如屏障功能、代謝反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)作用、宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答成熟等，與人類(lèi)的健康密切相關(guān)［1］。已有研究顯示早產(chǎn)兒腸道菌群的建立與晚發(fā)型敗血癥(LOS)和壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)有關(guān)［2］。盡管NEC的確切病因尚不清楚，但普遍認(rèn)為細(xì)菌的異常定植是重要原因之一［3］，而許多LOS由腸源性細(xì)菌易位引起［4］，并且腸道屏障的改變也會(huì)促成LOS和NEC的發(fā)生。早產(chǎn)兒由于各臟器發(fā)育不成熟，生后多處于NICU中，受到應(yīng)用抗生素、缺乏母乳喂養(yǎng)以及醫(yī)療操作(如腸外營(yíng)養(yǎng)、侵入性操作)等多方面的影響，導(dǎo)致其腸道菌群定植的模式及數(shù)量發(fā)生異常改變［5］。

研究表明能進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)菌僅占腸道菌群的1%～10%［6］，傳統(tǒng)培養(yǎng)法不能充分反映菌群的多樣性。變性梯度凝膠電泳(DGGE)［7，8］、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR［9］等非培養(yǎng)技術(shù)被用于腸道菌群的研究，但只能檢測(cè)出一定豐度以上的細(xì)菌或特定微生物。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)具備測(cè)序快、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，已成為研究腸道微生物的主要研究方法［10，11］，國(guó)外有報(bào)道采用該方法探討了早產(chǎn)兒腸道菌群與敗血癥的關(guān)系［10，12］，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。

1 方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 本研究采集早產(chǎn)兒生后不同時(shí)點(diǎn)的糞便樣本，采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析腸道菌群物種豐度、多樣性和構(gòu)成的變化趨勢(shì)，探討住院期間發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)或敗血癥或NEC早產(chǎn)兒腸道菌群定植模式。本文描述性報(bào)道預(yù)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) ①2014年2～3月復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院NICU住院的早產(chǎn)兒，胎齡≤34周或出生體重≤1 750 g;②排除住院時(shí)間＜7d患兒;③排除合并嚴(yán)重先天性心臟病、嚴(yán)重消化道畸形需手術(shù)的早產(chǎn)兒，排除唐氏綜合征、遺傳代謝病和重度窒息的早產(chǎn)兒。

1.3 SIRS和敗血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［13，14］SIRS定義為:①體溫＞38.5℃或＜36℃;②心動(dòng)過(guò)速(平均心率＞正常同年齡標(biāo)準(zhǔn)的2 s)，心動(dòng)過(guò)緩(平均心率＜正常同年齡標(biāo)準(zhǔn)的P10);③呼吸急促(平均呼吸頻率＞正常同年齡標(biāo)準(zhǔn)的2 s)或急性期機(jī)械通氣;④WBC升高或降低或CRP＞10mg·L-1。敗血癥定義為SIRS的基礎(chǔ)上血培養(yǎng)陽(yáng)性。

1.4 標(biāo)本采集 于生后第1天采集胎糞，之后計(jì)劃于每周齡時(shí)或評(píng)估敗血癥時(shí)采集糞便樣本，直至出院或生后8周。采用無(wú)菌通便的方法采集糞便，用無(wú)菌棉簽挑取新鮮糞便放入無(wú)菌凍存管后立即速凍，送至實(shí)驗(yàn)室提取DNA，余糞便樣本-80℃保存。

1.5 DNA提取 采用Powerfecal DNA Isolation Kit(MoBio，美國(guó))試劑盒提取100mg糞便樣本中微生物的總DNA，具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。所提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?.6 16S rRNA-V3區(qū)的PCR擴(kuò)增及測(cè)序 用提取的總DNA作為模板，16S PCR引物由測(cè)序接頭引物、Index和V3區(qū)引物3部分組成。Index為6 bp核苷酸隨機(jī)組成的序列，以標(biāo)記PCR產(chǎn)物的來(lái)源。PCR擴(kuò)增體系采用25μL:2 ×Master Mix(NEB，美國(guó))12.5μL，引物各 1.5μL，模板2.5μL，滅菌雙蒸水7μL(如模板DNA濃度較低則不加滅菌雙蒸水，加等體積的模板)。擴(kuò)增條件:98℃預(yù)變性30 s，98 ℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，20 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后將全部反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠染色)檢測(cè)擴(kuò)增片段大小，采用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，德國(guó))對(duì)目的條帶膠回收純化。

將純化后的16S rRNA-V3區(qū)的PCR產(chǎn)物送至清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Miseq。

1.7 生物信息學(xué)分析 將測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至MG-RAST服務(wù)器端 (http://metagenomics.anl.gov/)［15］，應(yīng)用 MG-RAST V3.3.6中的rRNAdetection pipeline進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)預(yù)處理去除低質(zhì)量的序列后，按照rRNA發(fā)現(xiàn)、聚類(lèi)和鑒定的步驟進(jìn)行分析。計(jì)算在97%的相似水平上每個(gè)樣本的操作分類(lèi)單元(OTU)數(shù)量，特定的分類(lèi)單元代表某特定物種，基于樣品測(cè)序產(chǎn)生的OTU的結(jié)果繪制稀疏曲線。計(jì)算單個(gè)樣本的Alpha多樣性(Shannon指數(shù))，指數(shù)越大表示該樣本中的物種越豐富。在門(mén)和科兩個(gè)分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)樣本的物種豐度，并行聚類(lèi)分析。

1.8 臨床資料截取 從病史中截取母親孕期的信息(胎膜早破、感染，妊娠高血壓、抗生素使用等)，喂養(yǎng)方式(母乳喂養(yǎng)或配方奶喂養(yǎng))，達(dá)足量喂養(yǎng)日齡，抗生素暴露，使用益生菌情況，感染(SIRS和敗血癥)和NEC發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 3例早產(chǎn)兒共采集了生后1、7、14和21d的12份糞便樣本，其中3例生后1d、例1生后7d和例2生后14d糞便樣本因PCR擴(kuò)增失敗，進(jìn)入測(cè)序分析的糞便樣本為7份。3例早產(chǎn)兒平均胎齡為(31.3±0.8)周，平均出生體重為(1 540±144)g。例1母親有胎膜早破19h伴發(fā)熱病史，產(chǎn)前有抗生素暴露史。3例早產(chǎn)兒生后均使用早產(chǎn)兒配方奶喂養(yǎng)，但達(dá)足量喂養(yǎng)的日齡有差別。3例早產(chǎn)兒生后早期均使用抗生素，但使用時(shí)間均＜7d。例2在生后26d診斷SIRS，并應(yīng)用抗生素治療，但分析的糞便樣本在感染前采集(表1)。

2.2 物種豐度及多樣性分析 7份糞便樣本的序列數(shù)分別為1 505 736(例 1生后 14d)、1 695 090(例 1生后21d)、241 694(例2 生后7d)、1 186 332(例2 生后21d)、1 193 486(例3生后7d)、1 082 270(例3生后14d)和671 600(例3生后21d)。

樣本稀疏曲線(圖1)顯示，在＜84 750條序列時(shí)，OTU數(shù)量隨序列數(shù)增加而迅速增加;在～339 000條序列時(shí)，OTU數(shù)目增加緩慢;之后則趨于平臺(tái)期。

各樣本的OTU數(shù)量:例1生后14和21d分別為533和608，例2生后7和21d分別為381和576，例3生后7、14和21d分別為409、571和524;各樣本的Shannon指數(shù):例1生后14和21d分別為2.61和7.15，例2生后7和21d分別為2.00和4.28，例3生后7、14和21d分別為7.69、7.04和8.44;均隨日齡增加呈升高趨勢(shì)。例2的2個(gè)時(shí)點(diǎn)樣本的Shannon指數(shù)均低于相同時(shí)點(diǎn)的例1和(或)例3樣本。

表1 3例早產(chǎn)兒的基本臨床特征Tab 1 Basic clinical characteristics of 3 infants

圖1 7份糞便樣本的稀疏曲線Fig 1 Rarefaction analysis of 7 samples

2.3 門(mén)水平下早產(chǎn)兒腸道菌群結(jié)構(gòu) 例1腸道菌群的組成不同于例2和3，以變形菌門(mén)占優(yōu)勢(shì)(66.94%vs 0.27%vs 0.14%)，其次為厚壁菌門(mén)(32.63%)。例2和3腸道菌群的組成相似，均以厚壁菌門(mén)占優(yōu)勢(shì)(分別占75.22%和83.51%)，其次為放線菌門(mén)(分別占24.51%和16.35%)。

7份樣本共檢測(cè)到18個(gè)菌門(mén)，每個(gè)樣本檢測(cè)到10～13個(gè)菌門(mén)，其中放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)、異常球菌-棲熱菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、變形菌門(mén)及柔壁菌門(mén)為共有菌門(mén)。表2顯示，7份樣本99.9%以上的序列主要是放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，但這4種優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在各樣本中所占比例存在差異。變形菌門(mén)在例1生后14d和21d樣本中分別占97.52%和49.11%，放線菌門(mén)在例2生后7d樣本中占99.46%，余4份樣本以厚壁菌門(mén)豐度最高(分別占93.85%、77.42%、84.67%和94.21%)。

2.4 科水平下早產(chǎn)兒腸道菌群結(jié)構(gòu) 7份樣本共檢測(cè)到172個(gè)科，每個(gè)樣本檢測(cè)到96～122個(gè)科，其中63科為7份樣本共有。對(duì)豐度≥1%的科進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，＜1%的計(jì)入其他。表3顯示，7份樣本中相對(duì)豐度較高的科共檢測(cè)到10個(gè)，除例1生后14d標(biāo)本以腸桿菌科為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌(96.46%)，例2生后7d樣本以棒狀桿菌科為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌(97.90%)外，其余樣品菌群的分布相對(duì)均勻。值得注意的是，例2生后21d樣本中葡萄球菌科所占比例較高(27.16%)，分類(lèi)到種水平主要為金黃色葡萄球菌和里昂葡萄球菌(分別占葡萄球菌科的71.5%和18.3%)。

2.5 早產(chǎn)兒腸道菌群結(jié)構(gòu)聚類(lèi) 由于鑒定出的菌門(mén)較少，而科水平較多，不宜行聚類(lèi)分析，故在綱水平對(duì)7份樣本進(jìn)行聚類(lèi)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)狀圖(圖2)，例1的2份、例2的2份和例3的3份樣本分別聚為一簇;7份樣本共鑒定出39個(gè)菌綱，其余11個(gè)為未分類(lèi)序列和未分配序列，共聚為5簇;豐度較高的菌群主要有放線菌綱，芽孢桿菌綱，梭菌綱，Negativicutes，α、β、γ、δ變形菌綱。

表2 3例早產(chǎn)兒不同時(shí)點(diǎn)糞便樣本在門(mén)水平的腸道菌群組成(%)Tab 2 Gut bacterial composition at phylum level per sample(%)

表3 3例早產(chǎn)兒不同時(shí)點(diǎn)糞便樣本在科水平的腸道菌群組成(%)Tab 3 Gut bacterial composition at family level per sample(%)

圖2 3例早產(chǎn)兒不同時(shí)點(diǎn)糞便樣本在綱水平的聚類(lèi)圖Fig 2 Heatmap at class level per sample atdifferent time points

3 討論

與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法及16S rDNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法不同，高通量測(cè)序技術(shù)基于16S rDNA的微生物群落分析中的要點(diǎn)，在于產(chǎn)生測(cè)序覆蓋深度極深的測(cè)序數(shù)據(jù)，并通過(guò)比對(duì)或聚類(lèi)的分析方法，對(duì)數(shù)據(jù)來(lái)源的微生物物種進(jìn)行分析，并估計(jì)微生物群落的物種構(gòu)成［16］。Illumina高通量測(cè)序技術(shù)是目前用于腸道微生物研究最前沿的檢測(cè)技術(shù)［17］，可以發(fā)現(xiàn)低豐度細(xì)菌或未知細(xì)菌，進(jìn)而全面、準(zhǔn)確地獲得菌群的信息。

新生兒腸道菌群的建立是一個(gè)緩慢漸進(jìn)的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程。通常認(rèn)為胎兒腸道是無(wú)菌的，但有證據(jù)表明宮內(nèi)環(huán)境有細(xì)菌存在，提示這些細(xì)菌可能影響新生兒出生前的微生物群［18，19］。早產(chǎn)兒胎糞中的細(xì)菌可能是宮內(nèi)來(lái)源的，反映了宮內(nèi)感染、繼發(fā)于早產(chǎn)胎膜早破的定植或母親抗生素應(yīng)用等宮內(nèi)暴露［10］。本研究3例早產(chǎn)兒胎糞樣本的細(xì)菌總DNA濃度非常低，16S rRNA-V3區(qū) PCR擴(kuò)增失敗，因此無(wú)法觀察到胎糞細(xì)菌的情況，當(dāng)然也不能排除DNA提取的問(wèn)題。

新生兒腸道菌群的建立和演變受多種因素的影響，如地理環(huán)境、胎齡、分娩方式、喂養(yǎng)方式、衛(wèi)生狀況及抗生素應(yīng)用等。與足月兒相比，早產(chǎn)兒腸道正常菌群的定植明顯延遲，達(dá)優(yōu)勢(shì)化時(shí)間也延遲［20］，且腸道菌群多樣性也較低。有研究表明某些微生物定植腸道存在一個(gè)胎齡臨界值，對(duì)于雙歧桿菌這一臨界值約為33周［21］。不同喂養(yǎng)方式的新生兒腸道菌群定植也存在差異。母乳喂養(yǎng)兒糞便中雙歧桿菌的量明顯高于人工喂養(yǎng)兒［22］。本文3例早產(chǎn)兒均采用配方奶喂養(yǎng)，但例3糞便樣本中雙歧桿菌的相對(duì)豐度要高于例1和2，回顧臨床資料發(fā)現(xiàn)例3胎齡最大，開(kāi)奶時(shí)間也最早，且喂養(yǎng)和住院過(guò)程較順利，促進(jìn)了消化道發(fā)育成熟，有利于早期形成完善的腸道微環(huán)境，使雙歧桿菌得以定植和繁殖。

長(zhǎng)期大量應(yīng)用抗生素對(duì)腸道正常菌群可造成損害，降低了正常菌群的定植抗力，有利于潛在致病菌的生長(zhǎng)，引起腸源性感染。應(yīng)用抗生素的新生兒，其糞便中腸桿菌、腸球菌的比例明顯增加，雙歧桿菌的比例下降，有些差異在抗生素治療結(jié)束后1個(gè)月仍然存在［23］。低出生體重兒早期應(yīng)用抗生素可顯著降低腸道菌群的多樣性［10］和糞便微生物的總數(shù)［24］。本文發(fā)現(xiàn)例1生后14d糞便樣本中腸桿菌科占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(主要是克雷伯菌屬)，雙歧桿菌科比例很小(＜1%)，腸道菌群的多樣性也較低，回顧資料發(fā)現(xiàn)，該患兒母親產(chǎn)前因胎膜早破伴發(fā)熱應(yīng)用了抗生素治療，且患兒于生后24h內(nèi)應(yīng)用了兩聯(lián)廣譜抗生素治療6d，可能與上述結(jié)果有關(guān)。盡管許多外部因素會(huì)對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群產(chǎn)生影響，但本文通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)同一個(gè)體不同時(shí)點(diǎn)腸道微生物構(gòu)成相似性較高，提示早產(chǎn)兒生后早期腸道菌群的構(gòu)成情況可能受遺傳因素或母親因素的影響要高于外部因素對(duì)其產(chǎn)生的影響。

本研究分析的3例早產(chǎn)兒住院過(guò)程中未發(fā)生NEC，例2在住院過(guò)程中發(fā)生了SIRS，其生后早期腸道菌群的多樣性一直處于較低水平，在感染發(fā)生前5d(生后21d)采集的糞便樣本發(fā)現(xiàn)了比例較高的葡萄球菌科(27.16%)，且主要為致病性的金黃色葡萄球菌，其條件致病菌腸球菌科所占的比例也顯著高于例1和3糞便樣本(63.71%vs 27.84%vs 33.63%)。Madan等［10］研究也發(fā)現(xiàn)發(fā)展為敗血癥的早產(chǎn)兒其生后腸道微生物多樣性較低，且以葡萄球菌占優(yōu)勢(shì)。葡萄球菌為共生菌，但當(dāng)其大量存在時(shí)也會(huì)成為易位細(xì)菌，從而成為NICU內(nèi)葡萄球菌敗血癥常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)的影響因素［25］。由于本文分析的病例數(shù)較少，初步探討了早產(chǎn)兒腸道菌群改變與敗血癥發(fā)生的關(guān)系，還需要更多樣本來(lái)驗(yàn)證這些結(jié)果。

總之，NICU內(nèi)早產(chǎn)兒腸道菌群的定植和演變受內(nèi)部因素和外部因素的影響發(fā)生了許多改變。經(jīng)驗(yàn)性、長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素會(huì)顯著降低腸道菌群的多樣性，影響正常菌群的定植。發(fā)展為敗血癥的早產(chǎn)兒生后腸道微生物多樣性較低，以致病菌占優(yōu)勢(shì)的腸道微生物區(qū)可能與敗血癥的發(fā)生相關(guān)。

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