狄恒建，莊 果，李俊松**

1江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，南京 210008；

2南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210029

狼毒，大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata.或狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有毒，具有逐水祛痰、散結(jié)殺蟲的功效[1]。狼毒生品藥性峻烈，毒副性作用大，經(jīng)醋炙后毒性降低，方可供臨床上內(nèi)服[2]?！吨袊?guó)藥典》2010年版“狼毒”項(xiàng)下載有飲片生狼毒和醋狼毒；“生品”項(xiàng)下僅有性狀、顯微和薄層鑒別、雜質(zhì)、水分、總灰分、浸出物和酸不溶性灰分等質(zhì)控項(xiàng)目；“醋品”項(xiàng)下則無質(zhì)控項(xiàng)目[3]。文獻(xiàn)多采用測(cè)定月腺大戟中主要藥效成分狼毒乙素和巖大戟內(nèi)酯B等含量的方法來評(píng)價(jià)其質(zhì)量的優(yōu)劣[4-5]。

中藥指紋圖譜是采用一定的分析手段，得到能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖[6-7]，其作為質(zhì)量控制模式可以綜合反映藥材中各主要成分及其相對(duì)含量，能提供更加豐富的質(zhì)量評(píng)價(jià)信息。為了更全面控制醋狼毒（月腺大戟）飲片質(zhì)量，本研究采用HPLC法建立了醋狼毒（月腺大戟）指紋圖譜。該方法可靠，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。儀（Agilent公司），含DAD檢測(cè)器；AG285電子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-3200E型超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

狼毒乙素、狼毒丙素對(duì)照品為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)波譜學(xué)方法鑒定結(jié)構(gòu)，并由色譜法確定其純度分別為99.0%和98.7%。

狼毒藥材來源見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉訓(xùn)紅教授鑒定為大戟科大戟屬植物月腺大戟的干燥根；樣品1～7號(hào)的醋炙飲片為本實(shí)驗(yàn)室按已考察過的炮制方法自制 （輔料醋用量為40%，悶潤(rùn)1 h至醋被吸收干凈，160℃下炒制10 min）；樣品8～10號(hào)為南京海昌中藥飲片公司按本實(shí)驗(yàn)室提供方法炮制的中試放大產(chǎn)品。

甲醇為分析純；乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；醋為江蘇鎮(zhèn)江恒順香醋 （總酸量≥4.5 g/100 mL）。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

Agilent1100四元泵全自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜

表1 樣品來源

2 色譜條件

Welchorm-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：乙腈（A%）-水（B%），梯度洗脫（0～10 min，10%～15%A；10～11 min，15%～33%A；11～20 min，33%～40%A；20～30 min，40%～66%A；30～40 min，66%～68%A；40～42 min，68%～70%A；42～45 min，70%～80%；45～50 min，80%～90%A；50～60 min，90%～90%A），平衡時(shí)間 5 min。 檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm；靈敏度：1.0 AUFS；柱溫：25℃；流速：l mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按狼毒乙素峰計(jì)算不小于3000。

3 溶液的制備

3.1 供試品溶液

取醋狼毒（月腺大戟）粉末（過6號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理 （功率250 w，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過，精取續(xù)濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液即得。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

取狼毒乙素適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含30 μg溶液，即得。

4 方法與結(jié)果

4.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

參考 《中藥注射劑指紋圖譜的技術(shù)研究 （暫行）》，考慮到各樣品中均有狼毒乙素峰且含量較高，其保留時(shí)間及峰形穩(wěn)定，分離度良好，故以此峰作為參照峰，計(jì)算醋月腺大戟HPLC指紋圖譜中其他色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，考察方法學(xué)。

4.1.1 精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)指紋圖譜。

結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.02%～0.71%，相對(duì)峰面積RSD均小于3%，6次進(jìn)樣共有圖譜的相似度均大于為0.96，精密度良好，符合指紋圖譜要求。

4.1.2 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批醋狼毒粉末5份，按“3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別檢測(cè)指紋圖譜。結(jié)果，以狼毒乙素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于4%，5次進(jìn)樣共有圖譜的相似度均大于0.99，重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

4.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液適量，分別于 0、2、4、8、12、24 h 檢測(cè)指紋圖譜。結(jié)果，各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜3%，共有圖譜的相似度＞0.9，供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜要求。

4.2 醋狼毒（月腺大戟）指紋圖譜共有模式的建立及相似度比較

4.2.1 醋狼毒（月腺大戟）指紋圖譜及特征峰的標(biāo)定對(duì)10批不同醋狼毒（月腺大戟）樣品按“3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄60 min內(nèi)的色譜圖。

采用 《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004年A版）》，對(duì)10批醋月腺大戟的指紋圖譜進(jìn)行考察，以保留時(shí)間約為26.55 min的12號(hào)色譜峰（狼毒乙素）作為參照峰，確定了23個(gè)共有特征指紋峰（見圖1），10批供試品的疊加圖見圖2。

圖1 醋狼毒（月腺大戟）HPLC指紋圖譜

圖2 醋狼毒（月腺大戟）10批供試品的共有模式圖

4.2.2 醋狼毒相似度比較參考《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，對(duì)10批醋狼毒指紋圖譜進(jìn)行相關(guān)技術(shù)參數(shù)的計(jì)算，結(jié)果顯示其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.9%，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.8%；通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)醋狼毒（月腺大戟）10批飲片指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)樣品相似度良好，平均相似度為0.962，結(jié)果見表2。

5 討 論

5.1 采用不同溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水）、不同提取方法（回流提取和超聲提取）及提取時(shí)間（20 min、30 min、60 min）對(duì)醋狼毒（月腺大戟）供試液提取方法進(jìn)行考察，并根據(jù)指紋圖譜對(duì)不同提取方法提取液進(jìn)行分析，結(jié)果表明，用甲醇作為溶劑超聲提取30 min就能夠?qū)⒋自孪俅箨谢瘜W(xué)成分較完全提取出來，且此方法提取10批生品樣品的相似度較好。

表2 10批醋狼毒 （月腺大戟）相似度計(jì)算結(jié)果

5.2 醋狼毒（月腺大戟）HPLC指紋圖譜可靠，建立的方法學(xué)良好，反映了醋狼毒的整體特征，可用于醋狼毒（月腺大戟）質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。

[1]徐樹楠，朱占民.神農(nóng)本草經(jīng)[M].石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，1994：131；1982：110.

[2]顏秉強(qiáng)，張永清.月腺大戟研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32（5）：432-5.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 （一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：269

[4]喬春峰，韓全斌，賀震旦，等.RP-HPLC法測(cè)定狼毒中巖大戟內(nèi)酯A和 B的含量 [J].藥物分析雜志，2006，26（9）：1204-6.

[5]謝演暉，嚴(yán)小紅，王燦堅(jiān)，等.RP-HPLC法測(cè)定月腺大戟中狼毒乙素的含量 [J].中藥材，2010，33 （4）：568-70；269.

[6]謝培山.中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術(shù)與應(yīng)用[J].中國(guó)中藥雜志，2001，26（10）：653.

[7]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）[J]. 中成藥，2000，22（10）：671.