姜偉奇

(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技中心病毒與免疫實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203)

蟾酥一詞源于《本草衍義》屬名貴中藥，為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)等的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液，經(jīng)加工干燥制成。主要產(chǎn)于中國(guó)河北、山東、江蘇、浙江等地。本品性味甘辛、溫、有毒，近年研究證明，蟾酥不僅可以鎮(zhèn)痛、消炎、麻醉，還有抗癌、抗輻射、強(qiáng)心等多種生物活性[1，2]。由于蟾酥在臨床治療癌癥方面具有確切藥理活性，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。本文將對(duì)蟾酥的化學(xué)成分和有關(guān)抗腫瘤作用加以綜述，旨在為蟾酥的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 蟾酥的化學(xué)成分

蟾酥的化學(xué)成分比較復(fù)雜，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)蟾酥中主要含有多種強(qiáng)心甾體類化合物。通過(guò)對(duì)蟾酥的分離和鑒定，目前已確定其主要化學(xué)成分按結(jié)構(gòu)分類如下[3-5]：(1)強(qiáng)心甾體類化合物，可分為：蟾毒配基類(bufogenins，BGs)、脂蟾毒配基(resibufogenin，RBG)、華蟾毒配基(cinobufagin，CBG)、遠(yuǎn)華蟾毒配基(telocinobufagin，TCBG)、蟾毒靈(bufalin，BL)、華蟾毒它靈(cinobufatalin)、日蟾毒它靈(gamabufotalinin)及南美蟾毒精等。(2)吲哚類生物堿及其衍生物，此類化合物含有吲哚環(huán)，是具有一定生物活性的水溶性吲哚生物堿，包含：蟾酥堿、蟾酥甲堿、5-羥色胺、去氫蟾酥堿等。(3)甾醇類，蟾酥含有膽甾醇、7α-羥基膽甾醇、7β-羥基膽甾醇、β-谷甾醇、麥角甾醇等。(4)其他類：近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的幾種成分，有20，21-環(huán)氧蟾毒內(nèi)酯、20S，21-環(huán)氧蟾毒配基、20R，21-環(huán)氧蟾毒配基、3-O-甲羧基-20S，21環(huán)氧蟾毒配基、3-O-20S，21-環(huán)氧蟾毒配基；蟾酥中尚含有腎上腺素及多種氨基酸。

目前研究表明，蟾酥及其活性成分具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。其中以有脂蟾毒配基、蟾毒靈和華蟾毒配基類化合物被認(rèn)為是蟾酥抗腫瘤作用的主要活性成分。

2 蟾酥的抗腫瘤作用

近年來(lái)有研究報(bào)道，蟾酥及其制劑可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因而成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。蟾酥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡需要多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，如線粒體途徑、死亡受體途徑、凋亡相關(guān)蛋白，如bcl-2，survivin，bax，p53基因和caspase蛋白等。其在蟾酥不同活性成分誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。

2.1 蟾酥對(duì)白血病細(xì)胞的作用 Zhu等[6]研究表明蟾毒靈能以劑量時(shí)間依賴的方式抑制人急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，蟾毒靈協(xié)同MEK抑制劑PD98059作用于NB4細(xì)胞后能夠下調(diào)survivin的表達(dá)，并促進(jìn)caspase-3的活化。說(shuō)明蟾毒靈誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡過(guò)程中與survivin 基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。在蟾毒靈誘導(dǎo)的人白血病細(xì)胞株HL-60凋亡過(guò)程中，Bcl-2表達(dá)水平降低的同時(shí)發(fā)生了Bcl-2的裂解。HL-60細(xì)胞中存在磷酸化的Bcl-2，在蟾毒靈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Bcl-2表達(dá)下調(diào)的同時(shí)磷酸化水平降低，即發(fā)生脫磷酸化。蟾毒靈短時(shí)間處理后，蛋白激酶C(PKC)總活性沒(méi)有明顯變化，但PKCβⅡ發(fā)生快速膜轉(zhuǎn)位，隨后出現(xiàn)了Bcl-2的脫磷酸化。表明蟾毒靈導(dǎo)人類白血病HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與Bcl-2表達(dá)下調(diào)、裂解及脫磷酸化有關(guān)，并且PKCβⅡ發(fā)生的膜轉(zhuǎn)位活化可能參與了Bcl-2的脫磷酸化[7，8]。曲秀娟等[9]在研究SYK和Cbl家族蛋白在蟾毒靈誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)蟾毒靈作用于HL-60細(xì)胞后，SYK蛋白快速被磷酸化，并以時(shí)間劑量依賴的方式下調(diào)Cbl和Cbl-b的表達(dá)，提示這可能也是蟾毒靈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制之一。劉云鵬等[10]在研究蟾毒靈誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞分化和凋亡中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞分化早期和細(xì)胞凋亡發(fā)生前，蟾毒靈明顯下調(diào)K562細(xì)胞WT1 mRNA和蛋白的表達(dá)，提示蟾毒靈誘導(dǎo)K562細(xì)胞向單核巨噬細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡可能與其對(duì)WT1的下調(diào)有關(guān)。盛秀勝等[11]還發(fā)現(xiàn)華蟾素能濃度依賴的抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)華蟾素誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與提高Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

2.2 蟾酥對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用 Yan等[12]利用MTT法檢測(cè)蟾毒靈對(duì)人腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的細(xì)胞增殖活力，發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對(duì)這2種細(xì)胞的增殖都有明顯的抑制作用并且呈時(shí)間劑量依賴。運(yùn)用western blot，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)等技術(shù)測(cè)定細(xì)胞中DR4和DR5基因mRNA的含量，從而判定細(xì)胞中DR4和DR5基因的表達(dá)水平，又利用caspase活性檢測(cè)和siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)檢測(cè)caspase-8的活化和PARP的裂解來(lái)進(jìn)一步探討蟾毒靈與TARIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡協(xié)同效應(yīng)的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明了在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中蟾毒靈能增強(qiáng)TARIL通過(guò)激活外源性凋亡途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并且蟾毒靈作用于細(xì)胞后與對(duì)照組相比DR4和DR5的表達(dá)顯著上調(diào)。同時(shí)研究證明蟾毒靈能上調(diào)DR4和DR5的表達(dá)是通過(guò)激活ERK、JNK和P38MAPK途徑并且下調(diào)Cbl-b實(shí)現(xiàn)的。Ma等[13]研究華蟾毒精誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的機(jī)制發(fā)現(xiàn)華蟾毒精能夠以劑量時(shí)間依賴的方式抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，當(dāng)用50μg/ml的華蟾毒精作用于細(xì)胞48 h后，早期細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比有顯著性差異，細(xì)胞周期阻滯在S期。利用原子力顯微鏡觀察到華蟾毒精能破壞細(xì)胞骨架改變細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。為進(jìn)一步研究華蟾毒精誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供新的思路。

2.3 蟾酥對(duì)肺癌細(xì)胞的作用 肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌病例的80～85%，其中大部分患者被診斷時(shí)已經(jīng)是晚期[14]。有研究證實(shí)[15～16]在體外實(shí)驗(yàn)條件下，采用不同濃度的蟾毒靈作用于A549細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)蟾毒靈能抑制細(xì)胞增殖，且呈劑量時(shí)間依賴。通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示蟾毒靈可以抑制Akt的活化，蟾毒靈與Akt抑制劑聯(lián)合作用于A549細(xì)胞后能誘導(dǎo)其凋亡，并能上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2和livin的表達(dá)，進(jìn)一步活化caspase-3。提示蟾毒靈誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡是通過(guò)抑制PI3K/Akt途徑實(shí)現(xiàn)的。陳同生等[17]采用基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)、熒光發(fā)射譜檢測(cè)分析以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)受體光漂泊技術(shù)，首次在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)檢測(cè)蟾酥誘導(dǎo)人肺腺癌(ASTC-a-1)細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase-3的活化特性。采用CCK-8技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蟾酥可以有效抑制ASTC-a-1細(xì)胞的增殖活性并具有劑量依賴性。用蟾酥處理穩(wěn)定表達(dá)FRET質(zhì)粒SCAT3的人肺腺癌ASTC-a-1細(xì)胞，采用熒光發(fā)射譜檢測(cè)分析以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移受體光漂白技術(shù)，2h后明顯觀察到活化的caspase-3將SCAT3切割為兩部分，并且SCAT3的切割程度隨著蟾酥作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，24 h內(nèi)細(xì)胞內(nèi)的SCAT3完全被切割。表明caspase-3 參與調(diào)控了蟾酥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。Sun[18]等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蟾毒靈作用于人肺腺癌ASTC-a-1 細(xì)胞時(shí)可以產(chǎn)生大量活性氧，同時(shí)增強(qiáng)caspase-3 活性，促使凋亡蛋白Bax 從細(xì)胞質(zhì)向線粒體移位，從而誘導(dǎo)ASTC-a-1 細(xì)胞凋亡。

2.4 蟾酥對(duì)肝癌細(xì)胞的作用 Qi等[19]發(fā)現(xiàn)蟾毒靈和華蟾毒精能顯著改變肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡形態(tài)，使凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑與上調(diào)Fas、Bax、Bid的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，同時(shí)降低線粒體膜電位，釋放細(xì)胞色素C，活化Caspase-3，8，9，10有關(guān)。提示蟾毒靈和華蟾毒精誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要是通過(guò)Fas和線粒體途徑介導(dǎo)的。另有研究表明蟾毒靈作用于HepG2后可使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期通過(guò)下調(diào)Aurora A、CDC25、CDK1、cyclin A并上調(diào)p53和p21蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低線粒體膜電位使細(xì)胞內(nèi)Ca水平和活性氧的產(chǎn)生增加，活化caspase-9和caspase-3[20]。

肖義秀等[21]通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脂蟾毒配基能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Bel-7402發(fā)生凋亡，其凋亡率超過(guò)50%，呈劑量依賴。脂蟾毒配基作用于Bel-7402后，Bax蛋白表達(dá)增加，對(duì)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，并與Bcl-2蛋白表達(dá)的下降有協(xié)同作用。黃應(yīng)申等[22]通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot等實(shí)驗(yàn)方法研究發(fā)現(xiàn)脂蟾毒配基還可引起線粒體跨膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放增多，活化Caspase-3，同時(shí)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.5 蟾酥對(duì)胃癌細(xì)胞的作用 Li等[23]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟾毒靈能劑量和時(shí)間依賴性的抑制胃癌細(xì)胞株MGC803的增殖，在低濃度為20 nmol/l下蟾毒靈可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在M期。在高濃度80 nmol/l下能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。一方面可能與下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值并活化caspase-3有關(guān)。另一方面，研究中還發(fā)現(xiàn)蟾毒靈能瞬時(shí)激活PI3K/Akt信號(hào)通路隨后再將其完全抑制，上調(diào)Cbl的表達(dá)，這些結(jié)果表明PI3K/Ak通路可能在蟾毒靈誘導(dǎo)胃癌MGC803細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。孟書(shū)聰?shù)萚24]利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率及其線粒體膜電位變化；Western blot檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)證明脂蟾毒配基能顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且呈劑量時(shí)間依賴。低劑量作用時(shí)間為24～48 h，將細(xì)胞阻滯在S期，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量少，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)阻滯細(xì)胞在G2/M 期。脂蟾毒配基引起細(xì)胞線粒體膜電位下降，釋放到胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C增多，促進(jìn)caspase-3活化，抑制Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步表明脂蟾毒配基可誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制與線粒體通路有關(guān)。

2.6 蟾酥對(duì)宮頸癌細(xì)胞 Cao等[25]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用10-8M的蟾毒靈作用于人宮頸癌Hela細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡程度具有時(shí)間依賴性。而且細(xì)胞中Tiam1蛋白含量開(kāi)始增加，在30 min后達(dá)到最大表達(dá)量，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)Tiam1蛋白表達(dá)水平逐漸下降。提示Taim1蛋白在蟾毒靈誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。王鸝等[26]采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法研究華蟾毒精抑制Hela細(xì)胞增殖作用機(jī)制，結(jié)果表明華蟾毒精對(duì)Hela細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。可使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)相對(duì)分子質(zhì)量較小的酸性蛋白表達(dá)有明顯的影響。Emam等[27]研究結(jié)果顯示，華蟾毒它靈作用于Hela細(xì)胞后，線粒體膜電位下降，細(xì)胞內(nèi)鈣離子和活性氧的產(chǎn)生增加。此外，華蟾毒它靈能上調(diào)Fas、Bid、Bax的表達(dá)并活化細(xì)胞色素C和caspase-2，-3，-8，-9，提示華蟾毒它靈誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)Fas和線粒體途徑介導(dǎo)的。

3 小結(jié)

蟾酥在中國(guó)的用藥歷史悠久，具有較強(qiáng)的藥理活性，受到研究者的廣泛關(guān)注。近年來(lái)的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)蟾酥及其活性成分對(duì)于白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞具有有效的抗癌活性。但蟾酥作為藥物使用可導(dǎo)致頭暈、惡心、抽搐甚至死亡[28]。這些毒副作用加大了臨床使用風(fēng)險(xiǎn)，不適合長(zhǎng)期連續(xù)服用。因此，要加強(qiáng)臨床前的實(shí)驗(yàn)研究，確定臨床有效的用藥劑量，提高臨床用藥的安全性和有效性。蟾酥成分復(fù)雜，目前的研究表明，蟾酥不同活性成分發(fā)揮抗腫瘤作用具有多靶點(diǎn)的特征。因此，需充分利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)全面深入的闡明蟾酥活性成分抗腫瘤的作用機(jī)制，為研制出高效低毒的抗癌藥物提供理論依據(jù)。

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