陳竹鋒,嚴(yán)維,王娜,張文輝,謝剛,盧嘉威,簡(jiǎn)智華,劉東風(fēng),唐曉艷,

1.深圳市作物分子設(shè)計(jì)育種研究院,深圳 518107;2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100089

雄性不育是影響水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一,但在另一方面,為了提高產(chǎn)量和獲取雜種優(yōu)勢(shì),在雜交育種過程中,雄性不育又具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值[1,2]。在水稻雜交制種過程中,雄性不育系的利用降低了生產(chǎn)成本,提高了制種產(chǎn)量,充分發(fā)揮了雜交的優(yōu)勢(shì)。同時(shí),雄性不育又是研究水稻花發(fā)育分子調(diào)控機(jī)理的重要研究材料[3～6]。因此,開展水稻育性基因克隆不僅具有生產(chǎn)利用價(jià)值,而且具有重要的理論意義。

突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料,近年來,利用水稻突變體進(jìn)行水稻功能基因組學(xué)研究取得重大進(jìn)展[7～11]。分離克隆相關(guān)基因是研究利用突變體的前提和基礎(chǔ),目前水稻突變體基因克隆最常用的技術(shù)有圖位克隆(Positional cloning)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(Transposon tagging)、T-DNA 插入(T-DNA tagging)和反向遺傳學(xué)(Reverse genetics)等技術(shù)。

但是,隨著各水稻基因組測(cè)序的完成以及二代測(cè)序技術(shù)的日趨成熟,MutMap克隆基因方法應(yīng)運(yùn)而生[12],該方法綜合運(yùn)用全基因組學(xué)、生物信息學(xué)、分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科交叉研究方法,結(jié)合高通量的二代測(cè)序方法,充分利用水稻重測(cè)序的數(shù)據(jù)及分析優(yōu)勢(shì),通過把突變體群體重測(cè)序結(jié)果與完全組裝的野生型基因組序列相比對(duì),找出水稻突變體基因。該方法大大降低了基因克隆成本,縮短了基因克隆時(shí)間。

本研究以 EMS(甲磺酸乙酯)誘變水稻品種黃華占得到的一個(gè)雄性不育突變體為研究材料,命名為osms55,對(duì)其進(jìn)行初步的表型鑒定、遺傳分析及遺傳背景鑒定,并利用改進(jìn)的 MutMap方法,結(jié)合HRM及cDNA序列比對(duì),成功克隆了該雄性不育基因。

1 材料和方法

1.1 材料

水稻雄性不育突變體osms55是本實(shí)驗(yàn)室用EMS誘變秈稻黃華占(HHZ)種子(處理濃度為 0.7%,處理時(shí)間12 h),進(jìn)一步篩選M2突變體庫(kù)而獲得,該突變體植株與野生型黃華占植株雜交,產(chǎn)生的 F1和F2代植株用于表型分析和遺傳分離分析。F2代的雄性不育植株用于MutMap 分析和基因克隆。所有植物材料種植于深圳作物分子設(shè)計(jì)育種研究院光明試驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 花粉育性觀察及表型鑒定

采用I2-KI染色方法鑒定水稻花粉育性。取成熟的水稻穎花,用鑷子將 6枚花藥取出置于載玻片上,用鑷子小心將花藥夾碎后浸于適量的1% I2-KI染液中 1～2 min,去除花藥壁等殘留物后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 突變體遺傳背景鑒定

采用基因組 DNA提取試劑盒(Qiagen),抽提突變體與野生型材料基因組 DNA,采用 Illumina Infinium iSelect SNP(50 K)芯片檢測(cè)技術(shù)[13],對(duì)比分析野生型黃華占與突變體的SNP位點(diǎn)差異,分析判斷突變體是否為黃華占來源。

1.2.3 不育基因克隆

將突變體材料與野生型材料雜交獲得 F1個(gè)體,F1自交獲得F2分離群體,種植F2群體,并從F2群體中挑選30株具有雄性不育表型的植株,取其葉片提取 DNA,等量混合形成 DNA pool,采用改進(jìn)的MutMap方法[12]克隆不育基因,并獲得基因序列和突變位點(diǎn)信息。

突變體DNA pool用超聲波方法隨機(jī)打斷,依照Illumina Paired-End DNA Sample Prep kit 建議的方法建庫(kù)。然后選取長(zhǎng)度為 200～300 bp之間的片段,采用Hiseq 2000平臺(tái)(PE101)進(jìn)行重測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量監(jiān)控,去除低質(zhì)量及接頭污染的數(shù)據(jù)后,通過SOAP2軟件[14],將數(shù)據(jù)比對(duì)到日本晴參考基因組上,得到比對(duì)到唯一位置的reads。然后利用這些數(shù)據(jù),采用SOAPsnp軟件[15]尋找突變體與日本晴參考基因組間的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。

采用同樣的方法測(cè)序并分析野生型 HHZ個(gè)體重測(cè)序數(shù)據(jù),得到野生型HHZ與日本晴之間的SNP位點(diǎn)。然后將osms55/日本晴 SNP與野生型 HHZ/日本晴 SNP相比較,去掉突變體中與野生型相同基因型的 SNP位點(diǎn)后,并根據(jù)野生型 HHZ Allele index≥0.8(唯一比對(duì)到該位點(diǎn)且支持野生型基因型的 reads數(shù)與所有覆蓋到該位置的 reads數(shù)的比值)以及覆蓋到該位點(diǎn)的reads≥5進(jìn)行篩選。計(jì)算篩選剩下的位點(diǎn)的 SNP index值,并將所有篩選剩下的位點(diǎn)在染色體上作圖。理論上,造成突變性狀的突變位點(diǎn)SNP index應(yīng)該等于1,即為純合位點(diǎn); 由于遺傳連鎖,其附近的 SNP位點(diǎn) index應(yīng)該等于或接近 1。尋找在染色體上成簇分布的 SNP位點(diǎn),再根據(jù)EMS誘變通常產(chǎn)生的突變,即G→A或 C→T突變,以及突變位點(diǎn)對(duì)所在基因的影響加以判斷,確定用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的突變位點(diǎn)。改進(jìn)的 MutMap方法將突變體群體測(cè)序結(jié)果和野生型基因組序列結(jié)果分別與日本晴參考基因組相比對(duì),利用 SNP index=1和差異位點(diǎn)分布等指標(biāo)找出候選突變基因。

1.2.4 基因型測(cè)定分型SNP

采用高分辨率溶解方法(High Resolution Melting,HRM)[16,17]鑒定 F2個(gè)體的基因型,將測(cè)序后已知基因型的材料作為對(duì)照,根據(jù)突變基因序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至Light Scanner中進(jìn)行掃描分型,通過熒光信號(hào)變化和自動(dòng)分型軟件繪制溶解曲線,軟件根據(jù)熒光值及曲線準(zhǔn)確將檢測(cè)樣品區(qū)分為野生純合型、雜合型、突變純合型。

1.2.5 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

樣品組織在液氮中進(jìn)行研磨后,采用 TRIzol(Invitrogen)法提取小穗中的總 RNA,采用 Super-Script?Ⅲ First Strand Synthesis Kit試劑盒(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA樣品。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板,通過PCR 方法擴(kuò)增野生型和突變體cDNA,用作序列分析。

表1 用于HRM分析的引物及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 osms55突變體表型鑒定

雄性不育突變體osms55在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期與野生型黃華占相比,植株表型上沒有明顯的差異。材料授粉灌漿25 d后,野生型黃華占結(jié)實(shí)率在85%以上,葉片逐漸衰老; 而osms55不結(jié)實(shí),谷?？瞻T,植株大部分葉片仍然青綠(圖1：a、b)。解剖觀察黃華占和突變體osms55成熟穎花,發(fā)現(xiàn)兩者花藥形態(tài)無明顯差異,突變體雌蕊外觀正常(圖1：c、d)。碘染結(jié)果表明突變體osms55花粉不能正常染色,以碘敗型花粉為主(圖1：e、f)。

2.2 osms55突變體的遺傳分析

突變體osms55與野生型的黃華占雜交,其 F1代植株花粉育性表現(xiàn)為正常,小穗結(jié)實(shí)率89.8%。F2代植株群體可明顯的區(qū)分為正常植株與不育植株兩組,在 1 351株的植株里,正常可育植株 1 020株,不育植株 331株,經(jīng)卡方(χ2)測(cè)驗(yàn),其分離比符合3∶1(表 2),表明osms55的突變性狀由單隱性核基因控制,將該基因命名為OsMS55。

2.3 突變體osms55的遺傳背景鑒定

利用Illumina Infinium iSelect SNP(50 K)芯片檢測(cè)技術(shù)[13]比較野生型黃華占與突變體osms55之間的SNP位點(diǎn)差異,鑒定突變體的遺傳背景。該芯片共有51,599個(gè)SNP位點(diǎn),均勻分布在水稻的12條染色體上。除去未檢測(cè)到的位點(diǎn),該方法共檢測(cè)到出48,040個(gè)SNP位點(diǎn); 其中突變體與野生型黃華占不同的位點(diǎn)有692個(gè),其中686個(gè)為雜合位點(diǎn),僅有6個(gè)純合位點(diǎn)與野生型黃華占不同,差異位點(diǎn)集中分布在特定的染色體區(qū)域(圖2)。初步判斷該突變體的遺傳背景與黃華占一致,突變體材料來源于黃華占。檢測(cè)到的這些差異位點(diǎn)可能基于以下兩方面的原因：(1)傳統(tǒng)育種方法培育的水稻品種來源姊妹系混合的小群體,而非單株遺傳;(2)自交繁殖世代相對(duì)較低。

圖1 突變體的表型特征

表2 突變體osms55與HHZ雜交F2代的表型分離

2.4 突變體osms55的基因克隆

突變體 DNA pool通過重測(cè)序,共得到 76 658 101 PE reads,采用SOAP2軟件[14]將數(shù)據(jù)比對(duì)到日本晴參考基因組上(http://rice.plantbiology.msu.edu/),覆蓋整個(gè)基因組89.53%,覆蓋深度為30×,比對(duì)到唯一位置的reads有90 071 940。利用這些比對(duì)到唯一位置的數(shù)據(jù),采用SOAPsnp軟件尋找與日本晴之間的單核苷酸多態(tài)性(SNP),共得到 1 146 971個(gè)SNP。采用同樣的方法測(cè)序野生型HHZ植株基因組,共獲得60 726 573 PE reads,reads長(zhǎng)度為44 bp,覆蓋整個(gè)基因組93.35%,覆蓋深度為13×,與日本晴基因組比對(duì)得到710 055 SNP位點(diǎn)。

圖2 osms55的遺傳背景鑒定

將野生型 HHZ/日本晴 SNP與突變體osmm55/日本晴SNP位點(diǎn)進(jìn)行比較,去掉突變體中與野生型相同基因型的位點(diǎn)后,根據(jù)野生型黃華占 Allele index≥0.8以及覆蓋到的 reads≥5進(jìn)行篩選,共得到1 732 SNP位點(diǎn),分布在水稻12條染色體的不同區(qū)域上(圖 3)。其中 29個(gè)位點(diǎn)在突變體中的 SNP index≥0.8,僅有 11個(gè)位于基因上(表3),其中某些位點(diǎn)可能是由于測(cè)序深度低或測(cè)序過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤而導(dǎo)致的假陽性位點(diǎn)。

LOC_Os03g23180、LOC_Os04g31310、LOC_Os08g21860、LOC_Os11g20239四個(gè)候選基因的突變位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域,LOC_Os01g25910、LOC_Os03g23180、LOC_Os08g02000、LOC_Os10g20980四個(gè)基因均為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座子,LOC_Os07g16950位于第3個(gè)exon結(jié)束前2 bp,且為同義突變。

根據(jù)重測(cè)序數(shù)據(jù)分析,挑選成簇分布且含有位于基因上造成氨基酸或基因變異的 SNP,僅有 2號(hào)染色體和 11號(hào)染色體上有符合的位點(diǎn),分別位于LOC_Os02g40450和 LOC_Os11g18290基因上。LOC_Os11g18290基因功能不明,其突變位于距離起始密碼子260 bp處,堿基C突變?yōu)門,導(dǎo)致該氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼帷６鳯OC_Os02g40450基因編碼一個(gè)DNA解旋酶,參與減數(shù)分裂過程中染色體的交叉互換過程[18],其突變位于基因第 4個(gè)內(nèi)含子的剪切識(shí)別位點(diǎn)上,堿基G突變?yōu)锳(圖4)。

2.5 利用HRM方法分析突變位點(diǎn)與性狀的遺傳連鎖關(guān)系

根據(jù)表3所列的候選基因突變位點(diǎn)變化及候選基因相關(guān)生物信息學(xué)分析,將LOC_Os02g40450、LOC_Os11g18290作為主要候選基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。隨機(jī)挑取11個(gè)可育植株與85個(gè)不育植株,利用表1中所設(shè)計(jì)的引物對(duì) LOC_Os02g40450、LOC_Os11g18290進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,采用 LightScanner軟件分析數(shù)據(jù),獲得SNP分型結(jié)果,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。

LOC_Os11g18290突變位點(diǎn)與不育表型不共分離,即突變體osms55的不育表型不是由該基因突變引起的; 而 LOC_Os02g40450突變位點(diǎn)與不育表型共分離,不育植株中該基因位點(diǎn)均發(fā)生突變,可育植株中該基因位點(diǎn)為純合野生型或雜合型,由此推斷,osms55突變體產(chǎn)生雄性不育是由于 LOC_Os02g40450基因在剪切識(shí)別位點(diǎn)處發(fā)生了突變,影響了RNA的正常剪切加工。

2.6 OsMS55基因cDNA序列比對(duì)分析

LOC_Os02g40450的突變位于第四內(nèi)含子的剪切識(shí)別位點(diǎn) GT-AG上,其中 AG的G突變?yōu)?A(圖4),為檢測(cè)突變體cDNA序列是否發(fā)生變異,提取野生型黃華占和突變體的總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,設(shè)計(jì)引物(5′-cttcagtgacat tgctctggtc-3′和 5′-cagtttgtgaaaggcactgtgc-3′)并 PCR擴(kuò)增后測(cè)序,結(jié)果表明,突變體osms55的剪切識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生變異后,OsMS55基因第5外顯子的前15 bp變?yōu)閮?nèi)含子,導(dǎo)致突變體蛋白比野生型少5個(gè)氨基酸。Blast分析發(fā)現(xiàn)LOC_Os02g40450基因與MER3基因同源,已有報(bào)道表明,MER3基因在5’UTR區(qū)及起始密碼子處的大片段缺失可導(dǎo)致雄性不育[18]。

圖3 1 732個(gè)SNP位點(diǎn)在12條染色體上的分布情況

表3 29個(gè)SNP index≥0.8的突變區(qū)域情況及功能注釋

圖4 OsMS55基因突變前后序列比對(duì)

表4 候選基因SNP分型統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討 論

植物的雄性生殖發(fā)育是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程,包括雄蕊分生組織分化,造孢細(xì)胞的產(chǎn)生和分化,減數(shù)分裂,小孢子母細(xì)胞成熟,開花及授粉等,這其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的基因發(fā)生突變,均能引起雄器官發(fā)育異常,最終產(chǎn)生雄性不育[19,20]。轉(zhuǎn)錄組分析表明,約 2.9萬個(gè)轉(zhuǎn)錄本在水稻的花藥發(fā)育和花粉形成的不同階段特異表達(dá)[21]。到目前為止,涉及水稻花藥發(fā)育和花粉形成的一些關(guān)鍵基因已被鑒定和研究,這些基因主要參與調(diào)控小孢子母細(xì)胞發(fā)育,絨氈層發(fā)育,花粉囊和花粉外壁發(fā)育等過程[22～26]。

MutMap方法是Abe等[12]2012年提出的一種基因克隆新方法,相較于圖位克隆方法,MutMap方法克隆基因更快捷、效率更高、成本更低,該方法是以二代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ),通過對(duì) F2分離群體中隱性表型個(gè)體的DNA pool的深度測(cè)序,然后把突變體群體測(cè)序結(jié)果與野生型基因組序列相比對(duì),找出造成突變體性狀的基因。MutMap方法不僅可以快速克隆質(zhì)量性狀的隱性核基因,還可以應(yīng)用到數(shù)量性狀的QTL 定位[27]。

MutMap方法對(duì)于克隆水稻育性發(fā)育相關(guān)基因尤其具有優(yōu)勢(shì),傳統(tǒng)圖位克隆方法為了開發(fā)更多的分子標(biāo)記,一般都采用秈粳雜交構(gòu)建定位分離群體,由此容易產(chǎn)生雜種不育而影響表型判斷,而利用回交等方法則增加基因克隆時(shí)間與工作量; MutMap只需將突變體與野生型材料雜交一次,自交獲得 F2分離群體即可,既簡(jiǎn)化了群體構(gòu)建的工作,又能準(zhǔn)確判斷材料表型。

本研究在Abe等[12]發(fā)表的MutMap方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),不再把突變體群體測(cè)序結(jié)果與野生型基因組序列直接比對(duì),而是把突變體群體測(cè)序結(jié)果和野生型基因組序列結(jié)果分別與日本晴參考基因組相比對(duì),找出各自比對(duì)的 SNP位點(diǎn)后,再把兩組SNP位點(diǎn)相比對(duì),找出差異位點(diǎn); 然后再利用 SNP index=1和差異位點(diǎn)分布等指標(biāo)找出候選突變基因。與 Abe等人的方法相比,本研究所采用的方法不要求精確組裝的野生型基因組序列作對(duì)照,只需要對(duì)突變體群體和野生型個(gè)體做 20～30×深度的重測(cè)序,即可通過與同一參考基因組相比對(duì),找出候選基因,大大降低了野生型基因組測(cè)序和組裝成本。

利用改進(jìn)的 MutMap方法,本研究成功地克隆到雄性不育osms55突變體的基因LOC_Os02g40450,該基因編碼的蛋白命名為 MER3[18],該基因突變后減數(shù)分裂染色體交叉(CO)數(shù)目顯著下降,而存在的少數(shù) CO也為隨機(jī)分布,從而導(dǎo)致水稻產(chǎn)生雄性不育。在Wang等[18]的研究中,mer3突變體中在5’UTR區(qū)及起始密碼子處有763 bp的缺失,導(dǎo)致MER3基因與其上游基因融合,最終因 MER3蛋白不能正確表達(dá)而產(chǎn)生雄性不育。本研究中osms55突變體的突變位點(diǎn)與 Wang等研究不同,是由于突變體基因內(nèi)含子剪切識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生變異,該變異導(dǎo)致內(nèi)含子剪切異常,從而產(chǎn)生雄性不育。

目前,水稻隱性雄性核不育材料主要應(yīng)用于作物育種的群體改良上,實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)基因疊加,優(yōu)化育種材料的遺傳背景,從而培育出優(yōu)良新品種或育種親本[28]。此外,于2009年立項(xiàng)啟動(dòng)實(shí)施了“水稻智能不育分子設(shè)計(jì)技術(shù)研究及新型不育系的創(chuàng)制”重點(diǎn)項(xiàng)目,開創(chuàng)了水稻隱性核雄性不育基因在雜交育種上利用的新局面(http://www.most.gov.cn/kjbgz/201009/t20100920_82153.htm)。

智能不育分子設(shè)計(jì)技術(shù)利用遺傳穩(wěn)定的隱性雄性核不育材料,通過轉(zhuǎn)入野生型基因恢復(fù)不育材料的花粉育性,同時(shí)使用殺花粉基因使含轉(zhuǎn)基因成分的花粉失活,并利用熒光基因分離篩選不育系與保持系種子[29]。該體系不僅有效解決了水稻隱性核雄性不育材料自我繁殖難題,建立了一套高效的雜交水稻育種和制種體系,開創(chuàng)了新的雜交育種途徑,拓寬了水稻雜種優(yōu)勢(shì)的利用空間,而且能夠解決常規(guī)雜交育種過程中資源利用率低、育種周期長(zhǎng)等瓶頸問題,提高雜交制種純度,降低雜交制種成本,同時(shí)也有效規(guī)避轉(zhuǎn)基因生物安全等問題。智能不育技術(shù)有效的將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合,使得大量水稻隱性雄性核不育基因及突變體材料的利用成為了可能。

本研究中的水稻突變體材料osms55所攜帶的隱性核不育基因不受光溫條件的影響,花粉以碘敗為主,雌蕊正常,任何常規(guī)品種均可以作為其恢復(fù)系,該突變體以及控制該突變體性狀的基因?yàn)闃?gòu)建新型雜交育種體系提供了必要的元件,克隆該突變基因,為今后的水稻分子設(shè)計(jì)育種提供更多可供選擇的基因及種質(zhì)資源。

[1]Li SQ,Yang DC,Zhu YG.Characterization and use of male sterility in hybrid rice breeding.J Integr Plant Biol,2007,49(6):791–804.

[2]Budar F,Pelletier G.Male sterility in plants:occurrence,determinism,significance and use.C R Acad Sci III,2001,324(6):543–550.

[3]Kaul MLH.Male sterility in higher plants.Berlin:Springer Verlag,1988:211–256.

[4]Araya A,Zabaleta E,Blanc V,Begu D,Hemould M,Mouras A,Litvak S.RNA editing in plant mitochondria,cytoplasmic male sterility and plant breeding.Electron J Biotechn,1998,1(1):31–39.

[5]Luo DP,Xu H,Liu ZL,Guo JX,Li HY,Chen LT,Fang C,Zhang QY,Bai M,Yao N,Wu H,Wu H,Ji CH,Zheng HQ,Chen YL,Ye S,Li XY,Zhao XC,Li RQ,Liu YG.A detrimental mitochondrial nuclear interaction causes cytoplasmic male sterility in rice.Nat Genet,2013,45(5):573–577.

[6]Xing YZ,Zhang QF.Genetic and molecular bases of rice yield.Annu Rev Plant Biol,2010,61(1):421–442.

[7]郭龍彪,儲(chǔ)成才,錢前.水稻突變體與功能基因組學(xué).植物學(xué)通報(bào),2006,23(1):1–13.

[8]Krishnan A,Guiderdoni E,An G,Hsing YI,Han CD,Lee MC,Yu SM,Upadhyaya N,Ramachandran S,Zhang Q,Sundaresan V,Hirochika H,Leung H,Pereira A.Mutant resources in rice for functional genomics of the grasses.Plant Physiol,2009,149(1):165–170.

[9]Wang NL,Long T,Yao W,Xiong LZ,Zhang QF,Wu CY.Mutant resources for the functional analysis of the rice genome.Mol Plant,2013,6(3):596–604.

[10]Yang Y,Li Y,Wu CY.Genomic resources for functional analyses of the rice genome.Curr Opin Plant Biol,2013,16(2):157–163.

[11]Jiang SY,Ramachandran S.Natural and artificial mutants as valuable resources for functional genomics and molecular breeding.Int J Biol Sci,2010,6(3):228–251.

[12]Abe A,Kosugi S,Yoshida K,Natsume S,Takagi H,Kanzaki H,Matsumura H,Yoshida K,Mistsuoka C,Muluneh T,Innan H,Cano L,Kamoun S,Teraushi R.Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap.Nat Biotechnol,2012,30(2):174–178.

[13]Chen HD,Xie WB,He H,Yu HH,Chen W,Li J,Yu RB,Yao Y,Zhang WH,He YQ,Tang XY,Zhou FS,Deng XW,Zhang QF.A high-density SNP genotyping array for rice biology and molecular breeding.Mol Plant,2013,Epub ahead of print.

[14]Li RQ,Yu C,Li YR,Lam TW,Yiu SM,Kristiansen K,Wang J.SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics,2009,25(15):1966–1967.

[15]Li RQ,Li YR,Fang XD,Yan HM,Wang J,Wang J.SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res,2009,19(6):1124–1132.

[16]Liew M,Seipp M ,Durtschi J,Margraf RL,Dames S,Erali M,Voelkerding K,Wittwer C.Closed-tube SNP genotyping without labeled probes-a comparison between unlabeled probe and amplicon melting.Am J Clin Pathol,2007,127(3):341–348.

[17]Zhou L,Wang L,Palais R,Pryor R,Wittwer CT.Highresolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution.Clin Chem,2005,51(10):1770–1777.

[18]Wang KJ,Tang D,Wang M,Lu JF,Yu HX,Liu JF,Qian BX,Gong ZY,Wang X,Chen JM,Gu MH,Cheng ZK.MER3 is required for normal meiotic crossover formation,but not for presynaptic alignment in rice.J Cell Sci,2009,122(12):2055–2063.

[19]Glover J,Grelon M,Craig S,Chaudhury A,Dennis E.Cloning and characterization of MS5 from Arabidopsis,a gene critical in male meiosis.Plant J,1988,15(3):345–356.

[20]譚何新,文鐵橋,張大兵.水稻花粉發(fā)育的分子機(jī)理.植物學(xué)通報(bào),2007,24(3):330–339.

[21]Guo JX,Liu YG.Molecular control of male reproductive devlopment and pollen fertility in rice.J Integr Plant Biol,2012,54(12):967–978.

[22]Yoshida H,Nagato Y.Flower development in rice.J Exp Bot,2011,62(14):4719–4730.

[23]Zhang DB,Luo X,Zhu L.Cytological analysis and genetic control of rice anther development.J Genet Genomics,2011,38(9):379–390.

[24]Zhang H,Liang WQ,Yang XJ,Luo X,Jiang N,Ma H,Zhang DB.Carbon Starved Anther encodes a MYB do-main protein that regulates sugar partitioning required for rice pollen development.Plant Cell,2010,22(3):672–689.

[25]Qin P,Tu B,Wang YP,Deng LC,Quilichini TD,Li T,Wang H,Ma BT,Li SG.ABCG15 encodes an ABC transporter protein,and is essential for post meiotic anther and pollen exine development in rice.Plant Cell Physiol,2013,54(1):138–154.

[26]Niu NN,Liang WQ,Yang XJ,Jin WL,Wilson Z A,Hu JP,Zhang DB.EAT1 promotes tapetal cell death by regulating aspartic proteases during male reproductive development in rice.Nat Commun,2013,4:1445.

[27]Takagi H,Abe A,Yoshida K,Kosugi S,Natsume S,Mitsuoka C,Uemura A,Utsushi H,Tamiru M,Takuno S,Innan H,Cano LM,Kamoun S,Terauchi R.QTL-seq:rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations.Plant J,2013,74(1):174–183.

[28]汪旭東,周開達(dá),李仕貴,黎漢云,高克銘.利用隱性核不育性進(jìn)行水稻輪回育種初步研究.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2001,14(3):102–106.

[29]鄧興旺,王海洋,唐曉艷,周君莉,陳浩東,何光明,陳良碧,許智宏.雜交水稻育種將迎來新時(shí)代.中國(guó)科學(xué)(生命科學(xué)),2013,43(10):864–868.