陳竹鋒,嚴(yán)維,王娜,張文輝,謝剛,盧嘉威,簡(jiǎn)智華,劉東風(fēng),唐曉艷,

1.深圳市作物分子設(shè)計(jì)育種研究院,深圳 518107;2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100089

雄性不育是影響水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一,但在另一方面,為了提高產(chǎn)量和獲取雜種優(yōu)勢(shì),在雜交育種過程中,雄性不育又具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值[1,2]。在水稻雜交制種過程中,雄性不育系的利用降低了生產(chǎn)成本,提高了制種產(chǎn)量,充分發(fā)揮了雜交的優(yōu)勢(shì)。同時(shí),雄性不育又是研究水稻花發(fā)育分子調(diào)控機(jī)理的重要研究材料[3～6]。因此,開展水稻育性基因克隆不僅具有生產(chǎn)利用價(jià)值,而且具有重要的理論意義。

突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料,近年來,利用水稻突變體進(jìn)行水稻功能基因組學(xué)研究取得重大進(jìn)展[7～11]。分離克隆相關(guān)基因是研究利用突變體的前提和基礎(chǔ),目前水稻突變體基因克隆最常用的技術(shù)有圖位克隆(Positional cloning)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(Transposon tagging)、T-DNA 插入(T-DNA tagging)和反向遺傳學(xué)(Reverse genetics)等技術(shù)。

但是,隨著各水稻基因組測(cè)序的完成以及二代測(cè)序技術(shù)的日趨成熟,MutMap克隆基因方法應(yīng)運(yùn)而生[12],該方法綜合運(yùn)用全基因組學(xué)、生物信息學(xué)、分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科交叉研究方法,結(jié)合高通量的二代測(cè)序方法,充分利用水稻重測(cè)序的數(shù)據(jù)及分析優(yōu)勢(shì),通過把突變體群體重測(cè)序結(jié)果與完全組裝的野生型基因組序列相比對(duì),找出水稻突變體基因。該方法大大降低了基因克隆成本,縮短了基因克隆時(shí)間。

本研究以 EMS(甲磺酸乙酯)誘變水稻品種黃華占得到的一個(gè)雄性不育突變體為研究材料,命名為osms55,對(duì)其進(jìn)行初步的表型鑒定、遺傳分析及遺傳背景鑒定,并利用改進(jìn)的 MutMap方法,結(jié)合HRM及cDNA序列比對(duì),成功克隆了該雄性不育基因。

1 材料和方法

1.1 材料

水稻雄性不育突變體osms55是本實(shí)驗(yàn)室用EMS誘變秈稻黃華占(HHZ)種子(處理濃度為 0.7%,處理時(shí)間12 h),進(jìn)一步篩選M2突變體庫(kù)而獲得,該突變體植株與野生型黃華占植株雜交,產(chǎn)生的 F1和F2代植株用于表型分析和遺傳分離分析。F2代的雄性不育植株用于MutMap 分析和基因克隆。所有植物材料種植于深圳作物分子設(shè)計(jì)育種研究院光明試驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 花粉育性觀察及表型鑒定

采用I2-KI染色方法鑒定水稻花粉育性。取成熟的水稻穎花,用鑷子將 6枚花藥取出置于載玻片上,用鑷子小心將花藥夾碎后浸于適量的1% I2-KI染液中 1～2 min,去除花藥壁等殘留物后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 突變體遺傳背景鑒定

采用基因組 DNA提取試劑盒(Qiagen),抽提突變體與野生型材料基因組 DNA,采用 Illumina Infinium iSelect SNP(50 K)芯片檢測(cè)技術(shù)[13],對(duì)比分析野生型黃華占與突變體的SNP位點(diǎn)差異,分析判斷突變體是否為黃華占來源。

1.2.3 不育基因克隆

將突變體材料與野生型材料雜交獲得 F1個(gè)體,F1自交獲得F2分離群體,種植F2群體,并從F2群體中挑選30株具有雄性不育表型的植株,取其葉片提取 DNA,等量混合形成 DNA pool,采用改進(jìn)的MutMap方法[12]克隆不育基因,并獲得基因序列和突變位點(diǎn)信息。

突變體DNA pool用超聲波方法隨機(jī)打斷,依照Illumina Paired-End DNA Sample Prep kit 建議的方法建庫(kù)。然后選取長(zhǎng)度為 200～300 bp之間的片段,采用Hiseq 2000平臺(tái)(PE101)進(jìn)行重測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量監(jiān)控,去除低質(zhì)量及接頭污染的數(shù)據(jù)后,通過SOAP2軟件[14],將數(shù)據(jù)比對(duì)到日本晴參考基因組上,得到比對(duì)到唯一位置的reads。然后利用這些數(shù)據(jù),采用SOAPsnp軟件[15]尋找突變體與日本晴參考基因組間的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。

采用同樣的方法測(cè)序并分析野生型 HHZ個(gè)體重測(cè)序數(shù)據(jù),得到野生型HHZ與日本晴之間的SNP位點(diǎn)。然后將osms55/日本晴 SNP與野生型 HHZ/日本晴 SNP相比較,去掉突變體中與野生型相同基因型的 SNP位點(diǎn)后,并根據(jù)野生型 HHZ Allele index≥0.8(唯一比對(duì)到該位點(diǎn)且支持野生型基因型的 reads數(shù)與所有覆蓋到該位置的 reads數(shù)的比值)以及覆蓋到該位點(diǎn)的reads≥5進(jìn)行篩選。計(jì)算篩選剩下的位點(diǎn)的 SNP index值,并將所有篩選剩下的位點(diǎn)在染色體上作圖。理論上,造成突變性狀的突變位點(diǎn)SNP index應(yīng)該等于1,即為純合位點(diǎn); 由于遺傳連鎖,其附近的 SNP位點(diǎn) index應(yīng)該等于或接近 1。尋找在染色體上成簇分布的 SNP位點(diǎn),再根據(jù)EMS誘變通常產(chǎn)生的突變,即G→A或 C→T突變,以及突變位點(diǎn)對(duì)所在基因的影響加以判斷,確定用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的突變位點(diǎn)。改進(jìn)的 MutMap方法將突變體群體測(cè)序結(jié)果和野生型基因組序列結(jié)果分別與日本晴參考基因組相比對(duì),利用 SNP index=1和差異位點(diǎn)分布等指標(biāo)找出候選突變基因。

1.2.4 基因型測(cè)定分型SNP

采用高分辨率溶解方法(High Resolution Melting,HRM)[16,17]鑒定 F2個(gè)體的基因型,將測(cè)序后已知基因型的材料作為對(duì)照,根據(jù)突變基因序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至Light Scanner中進(jìn)行掃描分型,通過熒光信號(hào)變化和自動(dòng)分型軟件繪制溶解曲線,軟件根據(jù)熒光值及曲線準(zhǔn)確將檢測(cè)樣品區(qū)分為野生純合型、雜合型、突變純合型。

1.2.5 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

樣品組織在液氮中進(jìn)行研磨后,采用 TRIzol(Invitrogen)法提取小穗中的總 RNA,采用 Super-Script?Ⅲ First Strand Synthesis Kit試劑盒(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA樣品。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板,通過PCR 方法擴(kuò)增野生型和突變體cDNA,用作序列分析。

表1 用于HRM分析的引物及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 osms55突變體表型鑒定

雄性不育突變體osms55在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期與野生型黃華占相比,植株表型上沒有明顯的差異。材料授粉灌漿25 d后,野生型黃華占結(jié)實(shí)率在85%以上,葉片逐漸衰老; 而osms55不結(jié)實(shí),谷粒空癟,植株大部分葉片仍然青綠(圖1：a、b)。解剖觀察黃華占和突變體osms55成熟穎花,發(fā)現(xiàn)兩者花藥形態(tài)無(wú)明顯差異,突變體雌蕊外觀正常(圖1：c、d)。碘染結(jié)果表明突變體osms55花粉不能正常染色,以碘敗型花粉為主(圖1：e、f)。

2.2 osms55突變體的遺傳分析

突變體osms55與野生型的黃華占雜交,其 F1代植株花粉育性表現(xiàn)為正常,小穗結(jié)實(shí)率89.8%。F2代植株群體可明顯的區(qū)分為正常植株與不育植株兩組,在 1 351株的植株里,正常可育植株 1 020株,不育植株 331株,經(jīng)卡方(χ2)測(cè)驗(yàn),其分離比符合3∶1(表 2),表明osms55的突變性狀由單隱性核基因控制,將該基因命名為OsMS55。

2.3 突變體osms55的遺傳背景鑒定

利用Illumina Infinium iSelect SNP(50 K)芯片檢測(cè)技術(shù)[13]比較野生型黃華占與突變體osms55之間的SNP位點(diǎn)差異,鑒定突變體的遺傳背景。該芯片共有51,599個(gè)SNP位點(diǎn),均勻分布在水稻的12條染色體上。除去未檢測(cè)到的位點(diǎn),該方法共檢測(cè)到出48,040個(gè)SNP位點(diǎn); 其中突變體與野生型黃華占不同的位點(diǎn)有692個(gè),其中686個(gè)為雜合位點(diǎn),僅有6個(gè)純合位點(diǎn)與野生型黃華占不同,差異位點(diǎn)集中分布在特定的染色體區(qū)域(圖2)。初步判斷該突變體的遺傳背景與黃華占一致,突變體材料來源于黃華占。檢測(cè)到的這些差異位點(diǎn)可能基于以下兩方面的原因：(1)傳統(tǒng)育種方法培育的水稻品種來源姊妹系混合的小群體,而非單株遺傳;(2)自交繁殖世代相對(duì)較低。

圖1 突變體的表型特征

表2 突變體osms55與HHZ雜交F2代的表型分離

2.4 突變體osms55的基因克隆

突變體 DNA pool通過重測(cè)序,共得到 76 658 101 PE reads,采用SOAP2軟件[14]將數(shù)據(jù)比對(duì)到日本晴參考基因組上(http://rice.plantbiology.msu.edu/),覆蓋整個(gè)基因組89.53%,覆蓋深度為30×,比對(duì)到唯一位置的reads有90 071 940。利用這些比對(duì)到唯一位置的數(shù)據(jù),采用SOAPsnp軟件尋找與日本晴之間的單核苷酸多態(tài)性(SNP),共得到 1 146 971個(gè)SNP。采用同樣的方法測(cè)序野生型HHZ植株基因組,共獲得60 726 573 PE reads,reads長(zhǎng)度為44 bp,覆蓋整個(gè)基因組93.35%,覆蓋深度為13×,與日本晴基因組比對(duì)得到710 055 SNP位點(diǎn)。

圖2 osms55的遺傳背景鑒定

將野生型 HHZ/日本晴 SNP與突變體osmm55/日本晴SNP位點(diǎn)進(jìn)行比較,去掉突變體中與野生型相同基因型的位點(diǎn)后,根據(jù)野生型黃華占 Allele index≥0.8以及覆蓋到的 reads≥5進(jìn)行篩選,共得到1 732 SNP位點(diǎn),分布在水稻12條染色體的不同區(qū)域上(圖 3)。其中 29個(gè)位點(diǎn)在突變體中的 SNP index≥0.8,僅有 11個(gè)位于基因上(表3),其中某些位點(diǎn)可能是由于測(cè)序深度低或測(cè)序過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤而導(dǎo)致的假陽(yáng)性位點(diǎn)。

LOC_Os03g23180、LOC_Os04g31310、LOC_Os08g21860、LOC_Os11g20239四個(gè)候選基因的突變位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域,LOC_Os01g25910、LOC_Os03g23180、LOC_Os08g02000、LOC_Os10g20980四個(gè)基因均為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座子,LOC_Os07g16950位于第3個(gè)exon結(jié)束前2 bp,且為同義突變。

根據(jù)重測(cè)序數(shù)據(jù)分析,挑選成簇分布且含有位于基因上造成氨基酸或基因變異的 SNP,僅有 2號(hào)染色體和 11號(hào)染色體上有符合的位點(diǎn),分別位于LOC_Os02g40450和 LOC_Os11g18290基因上。LOC_Os11g18290基因功能不明,其突變位于距離起始密碼子260 bp處,堿基C突變?yōu)門,導(dǎo)致該氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼?。而LOC_Os02g40450基因編碼一個(gè)DNA解旋酶,參與減數(shù)分裂過程中染色體的交叉互換過程[18],其突變位于基因第 4個(gè)內(nèi)含子的剪切識(shí)別位點(diǎn)上,堿基G突變?yōu)锳(圖4)。

2.5 利用HRM方法分析突變位點(diǎn)與性狀的遺傳連鎖關(guān)系

根據(jù)表3所列的候選基因突變位點(diǎn)變化及候選基因相關(guān)生物信息學(xué)分析,將LOC_Os02g40450、LOC_Os11g18290作為主要候選基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。隨機(jī)挑取11個(gè)可育植株與85個(gè)不育植株,利用表1中所設(shè)計(jì)的引物對(duì) LOC_Os02g40450、LOC_Os11g18290進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,采用 LightScanner軟件分析數(shù)據(jù),獲得SNP分型結(jié)果,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。

LOC_Os11g18290突變位點(diǎn)與不育表型不共分離,即突變體osms55的不育表型不是由該基因突變引起的; 而 LOC_Os02g40450突變位點(diǎn)與不育表型共分離,不育植株中該基因位點(diǎn)均發(fā)生突變,可育植株中該基因位點(diǎn)為純合野生型或雜合型,由此推斷,osms55突變體產(chǎn)生雄性不育是由于 LOC_Os02g40450基因在剪切識(shí)別位點(diǎn)處發(fā)生了突變,影響了RNA的正常剪切加工。

2.6 OsMS55基因cDNA序列比對(duì)分析

LOC_Os02g40450的突變位于第四內(nèi)含子的剪切識(shí)別位點(diǎn) GT-AG上,其中 AG的G突變?yōu)?A(圖4),為檢測(cè)突變體cDNA序列是否發(fā)生變異,提取野生型黃華占和突變體的總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,設(shè)計(jì)引物(5′-cttcagtgacat tgctctggtc-3′和 5′-cagtttgtgaaaggcactgtgc-3′)并 PCR擴(kuò)增后測(cè)序,結(jié)果表明,突變體osms55的剪切識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生變異后,OsMS55基因第5外顯子的前15 bp變?yōu)閮?nèi)含子,導(dǎo)致突變體蛋白比野生型少5個(gè)氨基酸。Blast分析發(fā)現(xiàn)LOC_Os02g40450基因與MER3基因同源,已有報(bào)道表明,MER3基因在5’UTR區(qū)及起始密碼子處的大片段缺失可導(dǎo)致雄性不育[18]。

圖3 1 732個(gè)SNP位點(diǎn)在12條染色體上的分布情況

表3 29個(gè)SNP index≥0.8的突變區(qū)域情況及功能注釋

圖4 OsMS55基因突變前后序列比對(duì)

表4 候選基因SNP分型統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討 論

植物的雄性生殖發(fā)育是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程,包括雄蕊分生組織分化,造孢細(xì)胞的產(chǎn)生和分化,減數(shù)分裂,小孢子母細(xì)胞成熟,開花及授粉等,這其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的基因發(fā)生突變,均能引起雄器官發(fā)育異常,最終產(chǎn)生雄性不育[19,20]。轉(zhuǎn)錄組分析表明,約 2.9萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)錄本在水稻的花藥發(fā)育和花粉形成的不同階段特異表達(dá)[21]。到目前為止,涉及水稻花藥發(fā)育和花粉形成的一些關(guān)鍵基因已被鑒定和研究,這些基因主要參與調(diào)控小孢子母細(xì)胞發(fā)育,絨氈層發(fā)育,花粉囊和花粉外壁發(fā)育等過程[22～26]。

MutMap方法是Abe等[12]2012年提出的一種基因克隆新方法,相較于圖位克隆方法,MutMap方法克隆基因更快捷、效率更高、成本更低,該方法是以二代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ),通過對(duì) F2分離群體中隱性表型個(gè)體的DNA pool的深度測(cè)序,然后把突變體群體測(cè)序結(jié)果與野生型基因組序列相比對(duì),找出造成突變體性狀的基因。MutMap方法不僅可以快速克隆質(zhì)量性狀的隱性核基因,還可以應(yīng)用到數(shù)量性狀的QTL 定位[27]。

MutMap方法對(duì)于克隆水稻育性發(fā)育相關(guān)基因尤其具有優(yōu)勢(shì),傳統(tǒng)圖位克隆方法為了開發(fā)更多的分子標(biāo)記,一般都采用秈粳雜交構(gòu)建定位分離群體,由此容易產(chǎn)生雜種不育而影響表型判斷,而利用回交等方法則增加基因克隆時(shí)間與工作量; MutMap只需將突變體與野生型材料雜交一次,自交獲得 F2分離群體即可,既簡(jiǎn)化了群體構(gòu)建的工作,又能準(zhǔn)確判斷材料表型。

本研究在Abe等[12]發(fā)表的MutMap方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),不再把突變體群體測(cè)序結(jié)果與野生型基因組序列直接比對(duì),而是把突變體群體測(cè)序結(jié)果和野生型基因組序列結(jié)果分別與日本晴參考基因組相比對(duì),找出各自比對(duì)的 SNP位點(diǎn)后,再把兩組SNP位點(diǎn)相比對(duì),找出差異位點(diǎn); 然后再利用 SNP index=1和差異位點(diǎn)分布等指標(biāo)找出候選突變基因。與 Abe等人的方法相比,本研究所采用的方法不要求精確組裝的野生型基因組序列作對(duì)照,只需要對(duì)突變體群體和野生型個(gè)體做 20～30×深度的重測(cè)序,即可通過與同一參考基因組相比對(duì),找出候選基因,大大降低了野生型基因組測(cè)序和組裝成本。

利用改進(jìn)的 MutMap方法,本研究成功地克隆到雄性不育osms55突變體的基因LOC_Os02g40450,該基因編碼的蛋白命名為 MER3[18],該基因突變后減數(shù)分裂染色體交叉(CO)數(shù)目顯著下降,而存在的少數(shù) CO也為隨機(jī)分布,從而導(dǎo)致水稻產(chǎn)生雄性不育。在Wang等[18]的研究中,mer3突變體中在5’UTR區(qū)及起始密碼子處有763 bp的缺失,導(dǎo)致MER3基因與其上游基因融合,最終因 MER3蛋白不能正確表達(dá)而產(chǎn)生雄性不育。本研究中osms55突變體的突變位點(diǎn)與 Wang等研究不同,是由于突變體基因內(nèi)含子剪切識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生變異,該變異導(dǎo)致內(nèi)含子剪切異常,從而產(chǎn)生雄性不育。

目前,水稻隱性雄性核不育材料主要應(yīng)用于作物育種的群體改良上,實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)基因疊加,優(yōu)化育種材料的遺傳背景,從而培育出優(yōu)良新品種或育種親本[28]。此外,于2009年立項(xiàng)啟動(dòng)實(shí)施了“水稻智能不育分子設(shè)計(jì)技術(shù)研究及新型不育系的創(chuàng)制”重點(diǎn)項(xiàng)目,開創(chuàng)了水稻隱性核雄性不育基因在雜交育種上利用的新局面(http://www.most.gov.cn/kjbgz/201009/t20100920_82153.htm)。

智能不育分子設(shè)計(jì)技術(shù)利用遺傳穩(wěn)定的隱性雄性核不育材料,通過轉(zhuǎn)入野生型基因恢復(fù)不育材料的花粉育性,同時(shí)使用殺花粉基因使含轉(zhuǎn)基因成分的花粉失活,并利用熒光基因分離篩選不育系與保持系種子[29]。該體系不僅有效解決了水稻隱性核雄性不育材料自我繁殖難題,建立了一套高效的雜交水稻育種和制種體系,開創(chuàng)了新的雜交育種途徑,拓寬了水稻雜種優(yōu)勢(shì)的利用空間,而且能夠解決常規(guī)雜交育種過程中資源利用率低、育種周期長(zhǎng)等瓶頸問題,提高雜交制種純度,降低雜交制種成本,同時(shí)也有效規(guī)避轉(zhuǎn)基因生物安全等問題。智能不育技術(shù)有效的將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合,使得大量水稻隱性雄性核不育基因及突變體材料的利用成為了可能。

本研究中的水稻突變體材料osms55所攜帶的隱性核不育基因不受光溫條件的影響,花粉以碘敗為主,雌蕊正常,任何常規(guī)品種均可以作為其恢復(fù)系,該突變體以及控制該突變體性狀的基因?yàn)闃?gòu)建新型雜交育種體系提供了必要的元件,克隆該突變基因,為今后的水稻分子設(shè)計(jì)育種提供更多可供選擇的基因及種質(zhì)資源。

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