孫廣鑫,欒雨時(shí),崔娟娟

大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,大連 116024

MicroRNA(miRNA)普遍存在于生物體內(nèi),是由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為22nt左右的單鏈非編碼小分子 RNA[1],可與 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC) 結(jié)合識(shí)別其靶mRNA。植物中miRNA序列高度保守并呈現(xiàn)出獨(dú)特的表達(dá)時(shí)序性和組織特異性。在植物細(xì)胞核中,內(nèi)源miRNA基因先形成前體轉(zhuǎn)錄本pri-miRNA,然后被加工形成較為穩(wěn)定的初級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu),再進(jìn)一步形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 pre-miRNA,最后經(jīng) DCL1酶剪切形成 miRNA/miRNA*雙鏈復(fù)合體,從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)形成成熟的 miRNA[2],與 RISC結(jié)合后作用于靶基因,發(fā)揮其翻譯阻遏或者降解作用[3]。miRNA參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的多種生理生化過程以及各種生物與非生物脅迫反應(yīng)[4]等。

番茄作為重要的園藝作物,不僅具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,而且在生命科學(xué)研究中也占有舉足輕重的地位。由于番茄具有易雜交、繁殖系數(shù)高、遺傳資源豐富、突變體庫(kù)較多、遺傳圖譜廣泛、遺傳轉(zhuǎn)化體系高效穩(wěn)定等特性,使其成為作物研究中的模式植物之一。在植物與病原物互作的研究方面,由于番茄基因組復(fù)雜且病原種類豐富,陸續(xù)得到了眾多的理論信息[5]。2009年,Feng等[6]率先檢測(cè)了與病毒相關(guān)的番茄 miRNA,其后的研究表明 miRNA在黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)、番茄卷葉新德里病毒(Tomato leaf curl new delhi virus,ToLCNDV)、番茄灰霉病等病害的防御和發(fā)生中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此,對(duì)miRNA的抗逆功能研究可為番茄種質(zhì)資源改良提供一定的理論依據(jù)。

目前對(duì) miRNA的挖掘主要有直接克隆(Direct cloning)、正向遺傳學(xué)(Forward genetics)篩選和生物信息學(xué)(Bioinformatics)分析等方法。直接克隆法比較簡(jiǎn)單,第一條植物miRNA就是用該方法發(fā)現(xiàn)的,很多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用這種方法從不同生物中發(fā)現(xiàn)了眾多miRNA[7～9],該方法更傾向于發(fā)現(xiàn)中、高量表達(dá)的miRNA,但很難發(fā)現(xiàn)一些表達(dá)量低、組織特異性強(qiáng)或受誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA。近年來,高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大地完善了該方法,并使得大規(guī)模鑒定miRNA成為可能[10,11],很多植物的miRNA都是通過高通量測(cè)序獲得的[12～14]。正向遺傳學(xué)篩選是在獲得突變個(gè)體后,將突變基因分離出來,從而得到一個(gè)新的產(chǎn)物。最初的lin-4和let-7就是利用正向遺傳學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)的[15,16],該方法可以清楚地了解miRNA的功能,但效率很低,只能鑒定到少量的miRNA,因此,正向遺傳學(xué)篩選方法無法成為發(fā)現(xiàn)miRNA的主要手段,只是在 miRNA研究早期使用較多。生物信息學(xué)分析方法可篩選出經(jīng)各種測(cè)序方法獲得的大量數(shù)據(jù)中的miRNA,它能夠彌補(bǔ)直接克隆法的不足,發(fā)現(xiàn)一些豐度低、組織特異性強(qiáng)或受誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA。隨著一些物種基因組序列、大量EST(Expressed sequence tag)和GSS(Genome survey sequences)等序列的公布,也可以不通過測(cè)序,而是根據(jù)miRNA的保守性和獨(dú)有的特征,利用生物信息學(xué)方法在基因組、EST和 GSS中預(yù)測(cè) miRNA前體,進(jìn)而找到保守的 miRNA,但通過該方法獲得的miRNA還需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以確定其真實(shí)性[17,18]。生物信息學(xué)分析方法快速、簡(jiǎn)單、高效,但是很難發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有miRNA無同源性的新的miRNA。

當(dāng)番茄受病原物侵染時(shí),體內(nèi)的多種miRNA及相關(guān)靶基因的表達(dá)量都會(huì)發(fā)生變化,說明miRNA在番茄響應(yīng)生物脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[19,20]。為了篩選出番茄體內(nèi)與致病密切相關(guān)的miRNA,本研究采用生物信息學(xué)手段,從Sanger miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)——miRBase(Release 20:June 2013,http://www.mirbase.org/)和已報(bào)道的文獻(xiàn)中找到34個(gè)miRNA的成熟序列,預(yù)測(cè)了它們的靶基因,利用Cytoscope軟件構(gòu)建這些 miRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從中篩選出miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和 miR6027,進(jìn)行了進(jìn)一步的分析及實(shí)時(shí)定量 PCR驗(yàn)證,為深入研究miRNAs的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

野生醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)材料L3708為本實(shí)驗(yàn)室保藏; 致病疫霉菌種P12103為西北農(nóng)林科技大學(xué)單衛(wèi)星教授惠贈(zèng)。通過NCBI、Web of Knowledge及文獻(xiàn)檢索等途徑,統(tǒng)計(jì)出番茄中與致病相關(guān)的 miRNA共 34個(gè)(表1),其中 miR156、miR159、miR160、miR162、miR166、miR167、miR169、miR171、miR172、miR319、miR395、miR397、miR399、miR482、miR5300、miR6022、miR6023、miR6024、miR6026和 miR6027是在miRBase中已經(jīng)登錄的。利用Primer5軟件分析設(shè)計(jì)其中 5個(gè) miRNA的上游引物序列及內(nèi)參基因Actin(GenBank:U60478.1)的上、下游引物序列(表 2)。

1.2 方法

1.2.1 致病相關(guān)miRNA序列的獲得及靶基因預(yù)測(cè)

從 Sanger miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)——miRBase(http://www.mirbase.org/search.shtml)(release 20)和已報(bào)道的文獻(xiàn)及其附件中收集到的34個(gè)miRNA全部家族成員的成熟序列。

將上述 miRNA利用軟件 psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget) 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。在Solanum Lycopersicon(tomato)、transcript、cDNA library version2.3數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)番茄miRNA的靶基因。預(yù)測(cè)參數(shù)除Maximum expectation設(shè)為5.0外,其余均使用程序默認(rèn)參數(shù)。

1.2.2 致病密切相關(guān)miRNA的篩選

利用Cytoscope軟件構(gòu)建病原誘導(dǎo)的miRNA及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)各靶基因的個(gè)數(shù)確定對(duì)應(yīng)圓點(diǎn)的大小,從中篩選出與致病密切相關(guān)的miRNA作為主要的研究和分析對(duì)象。

表1 番茄中與致病相關(guān)的34個(gè)miRNA

表2 設(shè)計(jì)的5個(gè)miRNA的上游引物及Actin的上、下游引物序列

1.2.3 致病密切相關(guān)miRNA的靶基因功能分析

根據(jù)上述靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果,針對(duì)篩選出的若干miRNA的靶基因名稱和 GO注釋號(hào)在 Uni-protKB(http://www.uniprot.org/help/uniprotkb)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中分析各靶基因的功能。統(tǒng)計(jì)出與病害相關(guān)的靶基因。

1.2.4 致病密切相關(guān)miRNA的啟動(dòng)子分析

針對(duì)篩選出的若干 miRNA 的基因 5′端上游1 500 bp的啟動(dòng)子片段,利用 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線程序進(jìn)行上游啟動(dòng)子預(yù)測(cè)及分析。找出與病害相關(guān)的啟動(dòng)子元件。

1.2.5 致病密切相關(guān)miRNA的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證

選取長(zhǎng)勢(shì)相同的番茄五葉期幼苗為試材,以106個(gè)孢子/mL的致病疫霉孢子懸浮液噴施葉片,分別于處理后 0 h、3h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)取樣,用RNAiso plus(TaKaRa,Japan)試劑盒提取總RNA,再用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,Japan)對(duì)樣品中的 miRNA進(jìn)行加尾,加上一個(gè)長(zhǎng)為60 bp左右的接頭,通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。本研究使用的各miRNA的上游引物見表2,下游引物為試劑盒中提供的通用引物Uni-miR qPCR Primer。反應(yīng)體系為 25 μL,包括：2 × SYBR?Premix ExTaqTM12.5 μL,cDNA 模板 2 μL,正反向引物各 1 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s; 95℃變性5 s; 60℃復(fù)性20 s,40個(gè)循環(huán)。用番茄Actin作為內(nèi)參基因,熒光數(shù)據(jù)在每個(gè)循環(huán)的復(fù)性末期采集。對(duì)得到的結(jié)果用 2-DDCt法分析繪出柱狀圖,并對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病密切相關(guān)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及篩選

整理分析psRNATarget在線預(yù)測(cè)出的miRNA及其靶基因。先構(gòu)建miRNA與靶基因間的Cytoscope調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。發(fā)現(xiàn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中有多個(gè)miRNA攜帶它的靶基因單獨(dú)存在,還有一部分miRNA是通過它們的靶基因與少數(shù)幾個(gè)miRNA相關(guān)聯(lián),而只有一部分miRNA(miR156、miR157、miR159、miR167、miR169、miR171、miR319、miR403、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和 miR6027)是通過它們的靶基因與多個(gè) miRNA相關(guān)聯(lián)形成了致密網(wǎng)絡(luò)。再以這13個(gè)分布較集中的 miRNA為研究對(duì)象構(gòu)建得到它們相互間的Cytoscope調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖1)。從圖1可知miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027的靶基因個(gè)數(shù)較多且與其他miRNA的關(guān)聯(lián)性較大(至少有4個(gè)相關(guān)聯(lián)的miRNA)。

2.2 致病密切相關(guān)miRNA的靶基因功能分析

圖1 致病密切相關(guān)各 miRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圓的大小與靶基因數(shù)目呈正相關(guān))

用psRNATarget在線軟件預(yù)測(cè)miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和 miR6027的靶基因,經(jīng)篩選后各獲得多條靶基因。根據(jù)各靶基因的名稱和GO注釋號(hào)在Uni-protKB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢每條靶基因的功能,可將它們分為 5類：(1)編碼與脅迫響應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì);(2)編碼與代謝相關(guān)的酶蛋白;(3)編碼與跨膜運(yùn)輸相關(guān)的蛋白質(zhì);(4)編碼轉(zhuǎn)錄因子;(5)未知蛋白。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn) miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和 miR6027編碼與脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的靶基因分別占各自總靶基因的22.45%、80.30%、71.43%、95.45%、59.09%和 100.00%?？梢?預(yù)測(cè)到的靶基因大部分與番茄的脅迫響應(yīng)相關(guān),其中有很多參與致病過程(表3)。

表3 與致病密切相關(guān)的各miRNA的靶基因

2.3 致病密切相關(guān)miRNA的啟動(dòng)子分析

應(yīng)用PlantCARE在線程序?qū)iR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027前體基因5′端上游1 500 bp的序列進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明,除 miR6027外,其他各成員的啟動(dòng)子區(qū)域不僅存在典型的具有轉(zhuǎn)錄起始功能的 TATA-box和CAAT-box,還存在多種脅迫相關(guān)的順式作用元件(包括激素響應(yīng)、光響應(yīng)、生物脅迫響應(yīng)、厭氧響應(yīng)、干旱響應(yīng)和溫度響應(yīng)元件等)以及與生物脅迫相關(guān)的啟動(dòng)子元件 TC-rich repeats; 同時(shí) miR169、miR482、miR5300和miR6026中還存在與生物脅迫相關(guān)的啟動(dòng)子元件Box-W1。由于不能確定miR6027在染色體上的具體位置,所以未對(duì)其進(jìn)行啟動(dòng)子分析。

2.4 致病密切相關(guān)miRNA的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證

5個(gè)miRNA的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果見圖2。致病疫霉處理后,番茄葉片中的miR169、miR482、miR6024、miR6026和 miR6027的表達(dá)量均在 3 h內(nèi)迅速降低,在24 h時(shí)普遍有所回升,在48 h時(shí)又降到最低點(diǎn)。以上結(jié)果說明這5個(gè)miRNA都能對(duì)致病疫霉處理做出響應(yīng)。且通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖 3)表明,miR169、miR482、miR6024、miR6026和miR6027的擴(kuò)增產(chǎn)物都在80 bp左右,說明符合預(yù)期長(zhǎng)度。

圖2 致病疫霉處理后5個(gè)miRNA的表達(dá)特性

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

3 討 論

近年來,miRNA作為基因調(diào)控因子備受矚目,已迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。眾所周知miRNA是植物對(duì)脅迫響應(yīng)過程中不可或缺的調(diào)控因子,它通過互補(bǔ)作用靶向mRNA抑制或降解相應(yīng)基因的表達(dá),參與調(diào)控生物體內(nèi)的各項(xiàng)生命活動(dòng)。本研究采用生物信息學(xué)分析方法構(gòu)建 Cytoscape網(wǎng)絡(luò)圖,欲篩選與致病密切相關(guān)的 miRNA,對(duì)選出的miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027進(jìn)行靶基因功能分析和啟動(dòng)子分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這6個(gè)miRNA的靶基因和啟動(dòng)子基本都與生物脅迫相關(guān),表明它們極可能參與了番茄對(duì)脅迫響應(yīng)的調(diào)控過程。為了探究各miRNA在致病疫霉處理下的表達(dá)情況,本文又對(duì)其中5個(gè)miRNA進(jìn)行了表達(dá)特性分析。發(fā)現(xiàn)這5個(gè)miRNA的表達(dá)量都有顯著變化,且趨勢(shì)基本一致,均在48 h時(shí)降到最低水平,說明這5個(gè)miRNA都能對(duì)致病疫霉的接種做出響應(yīng),且它們之間可能存在某些相似的通路。由于miR5300的引物特異性不理想,所以本文未對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。究竟在脅迫下各miRNA與其靶基因存在怎樣的相互關(guān)系,后者又是如何表達(dá)的,這些問題還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

番茄作為重要的栽培植物,在受到真菌、細(xì)菌、病毒以及線蟲和昆蟲的侵害時(shí)常造成大量減產(chǎn)[37],甚至絕收,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重影響。研究發(fā)現(xiàn),植物抗病(R)基因能夠識(shí)別病原物并引起過敏性反應(yīng),它作為防衛(wèi)系統(tǒng)的一員,在沒有病原物侵染時(shí)表達(dá)量很低,但當(dāng)病原物侵染后,能夠識(shí)別激發(fā)子,誘導(dǎo)抗病基因的過量表達(dá),并激活抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑,產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)[38],從而提高作物對(duì)病害的抗性。所以,克隆抗性基因?qū)?duì)研究植物和病原物互作、提高植物抗病性具有重要意義。近年來已從不同植物中克隆出了各種R基因。多數(shù)R基因具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域,其中NBS(Nucleotide binding site)是抗病基因核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。而NBS-LRR編碼基因是抗病基因中的最大家族,大約 3/4的抗病基因都來自于這一家族。根據(jù)N端信號(hào)肽的不同,又將NBS-LRR基因分為 TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR兩類[39,40]。這些抗病基因大量存在于植物基因組中,它的作用對(duì)象囊括了所有病原物[41]。經(jīng)靶基因功能分析發(fā)現(xiàn)篩選出的6個(gè)miRNA的靶基因中均含有NBS-LRR抗性蛋白,推測(cè)植物在受到病原物侵染時(shí),這 6個(gè)miRNA的表達(dá)量也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化,從而說明了我們篩選的miRNA的確是與致病密切相關(guān)的。并且已有實(shí)驗(yàn)證明,當(dāng)番茄植株受到CMV、TAV、Tolcv和灰霉病菌侵染時(shí),用基因芯片技術(shù)檢測(cè)到miR169表達(dá)量逐漸上調(diào),而其靶基因的表達(dá)量下調(diào),說明miR169參與了病原物的脅迫響應(yīng)。miR482、miR6024、miR6026和 miR6027也被預(yù)測(cè)到參與植物的免疫應(yīng)答過程,靶向植物的免疫受體[24]。

由于啟動(dòng)子控制著基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)程度,而某些miRNA的表達(dá)又具有時(shí)空特異性和組織特異性。所以,對(duì)啟動(dòng)子的研究將成為miRNA表達(dá)特性分析的重要工具[42]。研究發(fā)現(xiàn),大部分miRNA都含有獨(dú)立的啟動(dòng)子,是 RNA聚合酶Ⅱ的產(chǎn)物[43],經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而形成。所以,它的表達(dá)很有可能受到精確的調(diào)控。為進(jìn)一步剖析miRNA在脅迫下的表達(dá)模式,本研究利用 PlantCARE[44]對(duì)番茄miR169、miR482、miR5300、miR6024 和 miR6026基因上游啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在這些區(qū)域中存在共同的植物病原物侵染和損傷響應(yīng)順式作用元件TC-rich repeats和Box-W1。表明這些生物脅迫相關(guān)miRNA可能參與了相應(yīng)的逆境脅迫過程,也暗示植物在響應(yīng)生物脅迫時(shí)可能存在某些共同的通路。研究發(fā)現(xiàn)Box-W1存在于如芪合成酶(STS)和病程相關(guān)蛋白PR-1、Ypr-10中[45,46],位于多病原體侵染和非生物脅迫響應(yīng)基因 VvALDH2B8的啟動(dòng)子區(qū)域,能特異的結(jié)合WRKY轉(zhuǎn)錄因子[47],參與脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控。所以,這些脅迫響應(yīng)順式元件的存在為 miRNA參與植物抗逆反應(yīng)提供了證據(jù)。此外,番茄作為一種模式植物,挖掘和分析其與病害相關(guān)的 miRNA還有助于揭示植物與病原物互作的分子機(jī)制。

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