于珍,欒春杰,顧鳴敏

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,上海 200025

腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)是一類較常見(jiàn)的遺傳性周圍神經(jīng)疾病[1,2],全球的群體發(fā)病率約為1/2500[3]。該病主要呈常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant,AD),也可呈常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive,AR)及X連鎖隱性遺傳(X-linked recessive,XR)[3]。CMT病人在患病初期往往表現(xiàn)為弓形足及杵狀指,由于下肢無(wú)力而呈現(xiàn)跨越步態(tài)。隨著疾病的進(jìn)展,部分患者出現(xiàn)手部肌肉無(wú)力和萎縮,造成精細(xì)動(dòng)作困難。末端神經(jīng)功能的喪失還會(huì)導(dǎo)致感覺(jué)功能減退,如辨別冷熱的能力下降。該病大多在青少年期起病,也有少數(shù)于中年起病[4～6]。目前,除了理療、定制矯形支架或外科手術(shù)外,臨床上還缺乏有效的治療手段,藥物治療僅對(duì)個(gè)別亞型有一定的作用[7]。根據(jù)神經(jīng)電生理和病理生理變化主要將CMT分為兩種類型：脫髓鞘型和軸索型。脫髓鞘型CMT約占總數(shù)的 2/3,其中以呈AD遺傳的CMT1最為多見(jiàn),還包括呈AD遺傳的CMT3,呈XR遺傳的CMTX1和呈AR遺傳的CMT4。脫髓鞘型CMT的神經(jīng)電生理表現(xiàn)多為神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低,神經(jīng)病理表現(xiàn)為“洋蔥頭”樣改變[8,9]。軸索型CMT約占總數(shù)的1/3,均為呈AD或AR遺傳的 CMT2。CMT2各亞型的神經(jīng)電生理表現(xiàn)為神經(jīng)傳導(dǎo)速度正?；蜉p度減慢,僅復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(cMAP)有所降低; 神經(jīng)病理檢查多無(wú)“洋蔥頭”樣改變[8,9]。目前已報(bào)道51個(gè)基因突變均可導(dǎo)致CMT,但其中的4個(gè)基因(PMP22、GJB1、MPZ、MFN2)突變所致的CMT占總數(shù)的90%以上[7]。在CMT1中,最常見(jiàn)的是由外周髓鞘蛋白22基因(PMP22)重復(fù)突變所致的 CMT1A,約占所有 CMT的 36%; 其次是由髓鞘蛋白零基因(MPZ)突變所致的 CMT1B,約占CMT的8.5%。在X連鎖遺傳的CMT中,由間隙連接蛋白32基因(Cx32)突變所致的CMTX1約占所有CMT的10%。在CMT2中,由線粒體融合蛋白2基因(MFN2)突變所致的 CMT2A2最常見(jiàn),約占所有CMT中的5%和CMT2中的10%～30%[7,10]。然而,迄今對(duì)CMT的發(fā)病機(jī)制所知甚少,特別是導(dǎo)致CMT2的17個(gè)基因的致病機(jī)制尚缺乏較深入的研究?，F(xiàn)有的研究通常認(rèn)為CMT2的發(fā)生與軸索信號(hào)傳送障礙、線粒體膜融合異常、胞內(nèi)體的運(yùn)輸受限、神經(jīng)原纖維素的產(chǎn)生不足和線粒體分子伴侶的功能異常相關(guān)[11]。同時(shí)也認(rèn)為軸索變性是一種長(zhǎng)度依賴性病變,神經(jīng)纖維越長(zhǎng),維持長(zhǎng)距離軸漿運(yùn)輸所需線粒體及其所產(chǎn)生的能量越多,因此 CMT2首先影響四肢遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維,并逐步導(dǎo)致其所支配的肌肉發(fā)生萎縮[11]。

建立 CMT2動(dòng)物模型,不僅有助于從動(dòng)物水平闡明突變基因的生物學(xué)功能及致病機(jī)制,而且對(duì)未來(lái)的分子診斷和靶向治療也具有重要的指導(dǎo)意義[12]。常用的模式生物包括大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、斑馬魚(yú)(Danio rerio)、小鼠(Mus musculus)等。但用于遺傳病致病機(jī)制研究的動(dòng)物首選小鼠,理由是：①小鼠是地球上最小的哺乳動(dòng)物之一,易于飼養(yǎng)且繁殖量大; ②小鼠在生物進(jìn)化上與人類相近; ③人類 99%的基因存在于小鼠,基因同源性高達(dá) 78.5%,且小鼠基因組中約93%的基因排列順序與人類相同;④小鼠組織器官結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能與人類相似[13]。本文主要綜述了 CMT2小鼠模型的構(gòu)建策略、CMT2亞型及已建立的小鼠模型,舉例說(shuō)明幾種 CMT2小鼠模型的表型特征及分子機(jī)制,最后分析了該領(lǐng)域尚存在的問(wèn)題。

1 CMT2小鼠模型的構(gòu)建策略與方法

常用的CMT2小鼠模型包括轉(zhuǎn)基因小鼠、突變基因敲除小鼠和突變基因敲入小鼠等。下面簡(jiǎn)要介紹了這些小鼠模型的構(gòu)建策略和方法。

1.1 運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建CMT2小鼠模型

轉(zhuǎn)基因小鼠(Transgenic mice)是指通過(guò)細(xì)胞工程方法(如顯微注射技術(shù))將外源目的基因注入小鼠受精卵的雄原核,再將該受精卵植入假孕小鼠體內(nèi)使其生長(zhǎng)發(fā)育,最終篩選出基因組中整合了外源基因的新生小鼠[14]。完成鑒定的小鼠稱為首建鼠(Founder mice),將其進(jìn)一步繁育成遺傳學(xué)上穩(wěn)定的小鼠品系,就可用于相關(guān)醫(yī)學(xué)研究。例如,2008年中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院唐北沙課題組[15]通過(guò)位置候選克隆發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白 β8(HSPB8,也稱HSP22)為CMT2L的致病基因,并采用顯微注射技術(shù)建立了HSPB8K141N轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并對(duì)小鼠模型進(jìn)行了行為學(xué)、電生理學(xué)和病理學(xué)分析,以期再現(xiàn)CMT2L的臨床表型,用于 HSPB8 生物學(xué)功能分析和CMT2L發(fā)病機(jī)制研究。

1.2 運(yùn)用基因敲除技術(shù)構(gòu)建CMT2小鼠模型

基因敲除小鼠(Knock-out mice)是指利用同源重組原理,將完全失活或糾正的外源打靶基因取代內(nèi)源核基因組中的目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠[14]。目前常用的基因敲除方法有兩種：(1)組成型基因剔除：即在培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中直接將目的基因敲除或破壞,導(dǎo)致該基因失去功能; 該法易產(chǎn)生胚胎致死的后果,較難獲得理想的小鼠模型。(2)誘導(dǎo)型基因剔除：該法使目的基因的敲除發(fā)生在發(fā)育過(guò)程中人為設(shè)定的某一階段和特定的組織細(xì)胞中。由于該法在目的基因的兩側(cè)增加了 loxP位點(diǎn),同時(shí)也又增加了Cre基因,可滿足定時(shí)和定點(diǎn)失活目的基因的要求,故能避免胚胎致死的產(chǎn)生,是目前首選的基因剔除技術(shù)[16]。例如,2001年Zhao等[17]報(bào)道了由該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的驅(qū)動(dòng)蛋白 1B(Kif1B)基因敲除小鼠模型,以期模擬 CMT2A1的表型?；蚯贸∈驥if1B基因組來(lái)自一個(gè) ES細(xì)胞系 J1的λEMBL3基因庫(kù),包含P環(huán)和上游外顯子2.2 kb大小的區(qū)域被一個(gè)含較少poly(A)的neo篩選標(biāo)記替換,獲得的嵌合體小鼠經(jīng)過(guò)回交,得到的雜合子小鼠與雜合子小鼠交配獲得突變純合子小鼠模型。

1.3 運(yùn)用基因敲入技術(shù)構(gòu)建CMT2小鼠模型

基因敲入小鼠(Knock-in mice)是指利用同源重組原理,將外源目的基因插入到核基因組目標(biāo)基因序列的內(nèi)部或內(nèi)源目標(biāo)基因啟動(dòng)子之后的轉(zhuǎn)基因小鼠[14]。與基因剔除技術(shù)相比,該法的優(yōu)勢(shì)在于可在一個(gè)目標(biāo)基因的編碼區(qū)若干堿基被去除的同時(shí),另一個(gè)目標(biāo)基因編碼區(qū)的若干堿基被替換。采用這種方法可以研究具有完全不同結(jié)構(gòu)的兩個(gè)基因的產(chǎn)物是否具有相同的生物學(xué)功能[16]。已知髓鞘蛋白零基因(MPZ)編碼一種外周髓鞘的主要結(jié)構(gòu)蛋白,該基因突變會(huì)導(dǎo)致CMT2I/CMT2J/CMT1B等疾病。2012年Saporta等[18]報(bào)道了由該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的MpzR98C基因突變敲入小鼠模型。編碼MPZR98C的突變通過(guò)同源重組被定位到Mpz等位基因上。接著,通過(guò)定點(diǎn)誘變和序列分析證實(shí)該突變已被引入Mpz基因第3號(hào)外顯子中?？寺∑芜B接成含有新霉素抗性基因構(gòu)造的loxP位點(diǎn)。構(gòu)建的R98C neoLP和WT neoLP載體通過(guò)顯微注射進(jìn)入 TBV2胚胎干細(xì)胞。然后將陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞克隆入野生型小鼠的囊胚中獲得嵌合體。通過(guò)種系繁殖及鑒定,獲得遺傳背景為 FVB/N或C57BL/6N的MpzR98C敲入小鼠模型。

2 CMT2亞型及其小鼠模型概覽

迄今已報(bào)道的CMT2致病基因共有17個(gè),由此產(chǎn)生相應(yīng)的 CMT2亞型,包括本實(shí)驗(yàn)室近期報(bào)道的由脫氫酶 E1和轉(zhuǎn)酮酶結(jié)構(gòu)域 1(Dehydrogenase E1 and transketolase domain containing 1,DHTKD1)無(wú)義突變所致的CMT2Q[19]。在已經(jīng)報(bào)道的CMT2亞型中,有些亞型已建立了小鼠模型,并開(kāi)展了小鼠的表型分析及機(jī)制研究[20]; 有些亞型正在構(gòu)建小鼠模型,為后續(xù)研究作準(zhǔn)備。CMT2各亞型的遺傳方式、OMIM 編號(hào)、疾病基因名稱及定位、小鼠模型的構(gòu)建方法及主要特征等見(jiàn)表1。

3 部分 CMT2亞型小鼠模型的表型特點(diǎn)及病理機(jī)制

3.1 CMT2A1小鼠模型

已知驅(qū)動(dòng)蛋白 1B(KIF1B)突變會(huì)導(dǎo)致人類CMT2A1。該基因編碼兩個(gè)異構(gòu)體：KIF1Bα與KIF1Bβ。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn) KIF1Bβ與 KIF1Bα的底物結(jié)合域明顯不同。為了驗(yàn)證KIF1B基因在體內(nèi)的重要功能,該實(shí)驗(yàn)室成功建立了Kif1B基因敲除小鼠模型,其中突變純合子小鼠(Kif1B-/-)的出生率符合孟德?tīng)栠z傳定律,但是在出生30 min內(nèi)死亡。研究發(fā)現(xiàn)純合子小鼠出現(xiàn)肺泡不能擴(kuò)張,由此導(dǎo)致小鼠窒息和死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)新生的純合子小鼠表現(xiàn)出多種神經(jīng)異常,如對(duì)刺激反應(yīng)不敏感,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能喪失。與野生型小鼠(Kif1B+/+)相比,純合子小鼠大腦體積減少約 10%、腦干核心以及聯(lián)合纖維的形態(tài)及發(fā)育受損、神經(jīng)元數(shù)量減少(約 25%)、海馬體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及組織形態(tài)受損,突觸小泡的密度明顯降低。此外,背側(cè)及腹側(cè)骨髓網(wǎng)狀核(MdD和MdV)神經(jīng)元數(shù)量減少。雜合子小鼠(Kif1B+/-)在出生一年后才逐步表現(xiàn)出跨越步態(tài),最終不能支撐自身體重,只能通過(guò)偶爾的跳躍來(lái)移動(dòng)身體,表現(xiàn)出類似CMT2A1患者的特點(diǎn)。在滾軸、固定桿和握力實(shí)驗(yàn)中,雜合子比野生型小鼠明顯減弱; 而在測(cè)定感覺(jué)的熱板實(shí)驗(yàn)中,雜合子與野生型小鼠并沒(méi)有出現(xiàn)顯著性差異。為了進(jìn)一步探究肌無(wú)力的本質(zhì),直接刺激12月齡雜合子小鼠的足底肌,以測(cè)量坐骨神經(jīng)誘發(fā)的復(fù)合動(dòng)作電位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜合子小鼠的振幅有明顯變化,但神經(jīng)傳導(dǎo)速度沒(méi)有明顯改變。另外,遠(yuǎn)端肌肉的組織病理學(xué)分析也未見(jiàn)明顯差異。在雜合子小鼠中還觀察到腦干中心及結(jié)合處的軸索發(fā)育受損并且脊柱中軸索發(fā)育受損,這一現(xiàn)象被認(rèn)為是周圍神經(jīng)病變嚴(yán)重的特征。此外,Kif1B-/-神經(jīng)元的低存活率可以通過(guò) KIF1Bβ 的 cDNA 的表達(dá)來(lái)補(bǔ)救,而不是通過(guò) KIF1Bα,表明在神經(jīng)元中 KIF1Bβ表現(xiàn)出了自主行為,這與CMT2A1作為軸索病變而非髓鞘病變的臨床意義保持一致。課題組又分析了CMT2A1患者中KIF1B的序列,發(fā)現(xiàn)其ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在Q98L的錯(cuò)義突變。綜上所述,KIF1Bβ蛋白的改變降低了ATPase的活性和功能,并且由該基因產(chǎn)生的馬達(dá)蛋白含量減半,不能維持軸索所需的動(dòng)力,導(dǎo)致神經(jīng)末梢功能障礙,最后出現(xiàn) CMT2A1的表型。

表1 CMT2亞型及其小鼠模型一覽表

3.2 CMT2A2小鼠模型

1997年,Saito等[35]報(bào)道了一個(gè)日本家系患有CMT2A2。2004年,Zuchner等[36]確認(rèn)了線粒體融合蛋白2基因(MFN2)為CMT2A2的致病基因。MFN2是線粒體融合中必須的GTPase基因。2008年,Detmer等[21]構(gòu)建了在周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)人源Mfn2T105M基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,該小鼠通過(guò)劑量依賴效應(yīng)表現(xiàn)出典型的CMT2A2的臨床特征,其中雜合子小鼠出生時(shí)僅表現(xiàn)出輕微的短尾,而純合子小鼠出生時(shí)則出現(xiàn)明顯的短尾及畸形,還出現(xiàn)后肢緊縮,不能正常伸展,以及嚴(yán)重的步態(tài)異常。為了進(jìn)一步了解純合子小鼠后肢缺陷的原因,秤取了該小鼠腓腸肌的重量,發(fā)現(xiàn)突變純合子小鼠腓腸肌的重量明顯減輕,肌肉病理檢查也證實(shí)腓腸肌明顯萎縮。但小鼠轉(zhuǎn)軸實(shí)驗(yàn)和步態(tài)分析未見(jiàn)明顯異常。由于Mfn2T105M突變能引起線粒體分布缺陷,為此Detmer等檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中線粒體的形態(tài)學(xué)和分布,定量實(shí)驗(yàn)證實(shí)純合子小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中線粒體分布不均勻,出現(xiàn)線粒體異常聚集,推測(cè)這是導(dǎo)致軸索病變的原因。值得指出的是,小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中線粒體分布紊亂及產(chǎn)生的神經(jīng)病變只發(fā)生在過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠中,而未出現(xiàn)在基因敲入小鼠中,原因尚在分析中。

3.3 CMT2B1小鼠模型

1999年,Bouhouche等[37]報(bào)道了核纖層蛋白A/C(LMNA)基因突變(c.Arg298Cys)可導(dǎo)致CMT2B1。同年 Sullivan等[38]報(bào)道了純合型Lmna敲除小鼠表現(xiàn)出異常步態(tài)、后肢疲軟、前肢無(wú)法支撐整個(gè)身體因此行走姿勢(shì)僵硬,且在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)進(jìn)行性加重的脊柱側(cè)彎,但在同窩雜合子小鼠中未觀察到上述表型。為了進(jìn)一步了解LMNA純合突變對(duì)外周軸索損傷的作用,Sullivan等[38]對(duì)Lmna基因敲除小鼠的坐骨神經(jīng)進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)的分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變純合子小鼠坐骨神經(jīng)軸索密度大幅度降低,甚至出現(xiàn)無(wú)髓鞘軸索,這些表型都與2002年De Sandre-Giovannoli等[23]報(bào)道的 AR-CMT2患者的表型特征極為相似。以往的研究還表明LMNA基因突變與肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良 1B型(LGMD1B)、AD遺傳的Emery-Dreifuss肌營(yíng)養(yǎng)不良(AD-EDMD)和擴(kuò)張性心肌病伴心臟傳導(dǎo)阻滯 1A(CMD1A)等疾病有關(guān),表明核纖層蛋白A/C的不同功能域?qū)τ诰S持和整合不同細(xì)胞系的功能至關(guān)重要。因此不同疾病的相似特征在臨床診斷分型中需格外注意。

3.4 CMT2D小鼠模型

已知編碼甘氨酰-tRNA合成酶基因(GARS)的突變可導(dǎo)致人類CMT2D。2006年,Seburn等[25]通過(guò)定位克隆構(gòu)建了突變誘導(dǎo)的 Nmf249顯性小鼠模型。在該小鼠中,Gars基因有一段 AAATA取代了 CC,導(dǎo)致由該基因第 278位編碼的脯氨酸(Pro)突變?yōu)槔野彼?Tyr)和賴氨酸(Lys),結(jié)果突變純合子小鼠(GarsNmf249/Nmf249)出現(xiàn)胚胎致死現(xiàn)象,而雜合子小鼠(GarsNmf249/+)則出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)感覺(jué)神經(jīng)疾病的癥狀,還在3周齡時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)肌肉功能障礙,尤以遠(yuǎn)端肌肉為甚,體型較小,壽命縮短。病理檢查發(fā)現(xiàn)軸索直徑減小,大直徑軸索數(shù)量減少,神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)的突觸連接處及肌肉出現(xiàn)去神經(jīng)化病理改變,但未發(fā)現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象。神經(jīng)電生理檢查顯示突變小鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著降低(約下降 60%)。分子生物學(xué)分析顯示該突變并未影響Gars基因的mRNA表達(dá),并且對(duì)甘氨酰-tRNA合成酶的酶動(dòng)力學(xué)以及酶的活性都沒(méi)有產(chǎn)生影響。Seburn等[25]認(rèn)為這些現(xiàn)象不能用單倍體缺失效應(yīng)或者顯性負(fù)性效應(yīng)來(lái)解釋,因此提出了另一種假設(shè),即GarsNmf249基因突變引起的外周神經(jīng)病變與甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)蛋白的功能異常有關(guān),而與GlyRS活性喪失無(wú)關(guān)。

3.5 CMT2E小鼠模型

人體中神經(jīng)絲蛋白輕鏈(NF-L,又稱 NEFL)的突變與 CMT2E相關(guān),受累者的嚴(yán)重程度隨不同突變而有所不同,且同一突變?cè)诓煌彝ブ幸矔?huì)有所不同,呈現(xiàn)出異質(zhì)性的特征。為了研究該病的致病機(jī)制,Shen等[28]構(gòu)建了一種新的CMT2E小鼠模型,該小鼠持續(xù)表達(dá)帶有人類hNF-LE397K基因突變的產(chǎn)物。表型分析發(fā)現(xiàn),不同年齡階段小鼠體內(nèi) hNF-L受限程度不同,并表現(xiàn)出進(jìn)行性加重的現(xiàn)象。其中1月齡hNF-LE397K小鼠以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體(NFs)磷酸化的異位積累為特征,表現(xiàn)出相對(duì)較輕的神經(jīng)病變。4月齡小鼠出現(xiàn)明顯的表型,包括異常的后肢姿勢(shì),足趾畸形,自發(fā)性活動(dòng)減少,感覺(jué)神經(jīng)的軸索數(shù)量減少,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCVs)降低。有趣的是,隨著年齡增大,突變小鼠并未出現(xiàn) NFs在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的大量累積,NF網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)似乎也沒(méi)有受到大范圍的影響。下肢遠(yuǎn)端肌肉萎縮,但仍然受坐骨神經(jīng)的支配,也未去神經(jīng)化。Shen等[28]推測(cè)產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與突變小鼠肌肉的感覺(jué)神經(jīng)支配發(fā)生的改變有關(guān),即因大量感覺(jué)神經(jīng)的軸索缺失造成后肢姿勢(shì)異常。除了hNF-LE397K小鼠模型外,目前還建成了hNF-LP22S小鼠模型[30],兩者相比在表型方面較為相似,但在病理機(jī)制方面則存在差異,說(shuō)明不同功能域改變可導(dǎo)致不同的病理變化。

3.6 CMT2F小鼠模型

2001年,Ismailov等[39]首次報(bào)道熱休克蛋白 β1(HSPB1)基因突變(S135F)可導(dǎo)致人類CMT2F。2011年,d’Ydewalle等[32]建立了人源Hspb1S135F轉(zhuǎn)基因小鼠,表型分析顯示該小鼠具有軸索性CMT受累者的臨床和病理特征。所有轉(zhuǎn)基因小鼠出生時(shí)均正常,符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律,存活率與野生型小鼠相比沒(méi)有顯著差異。6個(gè)月后進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Hspb1S135F突變小鼠的后肢出現(xiàn)萎縮病變; 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(轉(zhuǎn)軸和熱板實(shí)驗(yàn))顯示突變小鼠出現(xiàn)進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)損傷,肌張力降低。6～8月齡小鼠的復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(cMAPs)的波幅明顯降低,且感覺(jué)神經(jīng)動(dòng)作電位(SNAPs)中基線到波峰的振幅明顯降低。該課題組認(rèn)為Hspb1S135F小鼠表型可用功能獲得性機(jī)制解釋。研究還發(fā)現(xiàn)由Hspb1S135F小鼠中分離的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元細(xì)胞中線粒體運(yùn)輸受到嚴(yán)重影響。進(jìn)一步分析顯示沿著軸索的胞內(nèi)運(yùn)輸需動(dòng)力蛋白在指定的分子(如乙?；?α-微管蛋白)作用下運(yùn)送“貨物”。對(duì)于線粒體運(yùn)輸而言,移動(dòng)的線粒體會(huì)優(yōu)先定位于乙?；奈⒐芴?。如果 α-微管蛋白乙酰化過(guò)程受阻就容易導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的產(chǎn)生。d’Ydewalle 等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠外周神經(jīng)中乙酰化的 α-微管蛋白總量大幅降低。但是,抑制微管蛋白去乙酰化酶(HDAC6)可以重新調(diào)節(jié)乙?；?α-微管蛋白水平,緩解軸索運(yùn)輸障礙,表明Hspb1突變導(dǎo)致的 CMT2F 可能存在去乙酰化機(jī)制。使用α-微管蛋白乙?；种苿┲委烪spb1突變小鼠,能在行為學(xué)與電生理水平部分修復(fù)CMT2F的表型,表明α-微管蛋白乙?；降慕档驮谟蒆SPB1突變導(dǎo)致的CMT2F的致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

3.7 CMT2Q小鼠模型

我們對(duì)來(lái)自山東高密的一個(gè)CMT2大家系進(jìn)行了研究。全基因組掃描和連鎖分析顯示疾病表型與10p12-14緊密連鎖,該區(qū)域覆蓋 D10S585與D10S1477之間的微衛(wèi)星標(biāo)記,共5.41 Mb。DNA序列分析發(fā)現(xiàn)所有受累者的脫氫酶 E1和轉(zhuǎn)酮酶結(jié)構(gòu)域 1基因(DHTKD1)第 8外顯子存在一個(gè)無(wú)義突變[c.1455T>G(p.Tyr485*)][19]。進(jìn)一步研究顯示受累者外周血中DHTKD1的mRNA表達(dá)水平只有未受累者的一半。細(xì)胞水平研究顯示在轉(zhuǎn)染了帶無(wú)義突變的mRNA和截短蛋白的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解速度明顯快于野生型細(xì)胞。沉默無(wú)義介導(dǎo)的 mRNA降解(NMD)途徑中的促進(jìn)因子UPF1能有效地阻止因無(wú)義突變所造成的mRNA和蛋白質(zhì)水平的下降[40]。更為重要的是,沉默DHTKD1可導(dǎo)致細(xì)胞能量產(chǎn)生的受限,表現(xiàn)為 ATP、總 NAD+和 NADH,以及NADH水平的下降。綜上所述DHTKD1的無(wú)義突變是導(dǎo)致CMT2Q的分子基礎(chǔ),提示DHTKD1在線粒體能量產(chǎn)生及神經(jīng)發(fā)育中起著重要作用[19]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者有關(guān)DHTKD1基因功能的研究?jī)H限于體外研究,活體內(nèi)的研究尚未展開(kāi),所以對(duì)于DHTKD1的功能缺失作用能否在小鼠體內(nèi)再現(xiàn)尚不明確。為了更好地研究DHTKD1基因的生物學(xué)功能及該基因突變導(dǎo)致CMT2Q的分子機(jī)制,我們利用Red/ET同源重組技術(shù)構(gòu)建了Dhtkd1點(diǎn)突變基因敲入打靶載體,通過(guò)同源重組技術(shù)成功地在Dhtkd1基因第8號(hào)外顯子和第9號(hào)外顯子之間插入1個(gè)Lox P位點(diǎn)、2個(gè)Frt及1個(gè)neo篩選標(biāo)記,通過(guò)囊胚腔注射獲得嵌合體小鼠,并通過(guò)與野生型小鼠交配得到含有突變位點(diǎn)的雜合子小鼠。接著,雜合子小鼠互相交配得到突變純合子、雜合子與野生型小鼠,為下一步從動(dòng)物水平研究Dhtkd1基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)[34]。目前進(jìn)行的表型分析顯示 3種基因型小鼠的繁殖情況正常,野生型、雜合子和純合子小鼠的比例符合孟德?tīng)栠z傳定律(1∶2∶1),并未出現(xiàn)純合子胚胎致死或早亡。3種基因型小鼠坐骨神經(jīng)的病理學(xué)分析(包括半薄切片光鏡和電鏡觀察)顯示突變純合子小鼠軸索中大徑纖維的比例明顯少于野生型小鼠,且髓鞘出現(xiàn)內(nèi)陷、外凸或畸形的比例也高于野生型小鼠。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野生型小鼠坐骨神經(jīng)和肝臟中DHTKD1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)水平最高,突變純合子最低,雜合子介于二者之間。突變純合子小鼠腎臟中DHTKD1未檢出、雜合子僅為野生型的一半含量; 能量代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變純合子小鼠的ATP含量明顯低于野生型,且NADP+/NADPH的比值也存在顯著性差異。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示突變純合子小鼠較野生小鼠的感覺(jué)遲鈍(足爪熱痛實(shí)驗(yàn)); 野生型小鼠在滾軸上持續(xù)的時(shí)間高于雜合子和純合子(滾軸試驗(yàn))?？紤]到在人體中CMT2Q屬晚發(fā)型、漸進(jìn)性疾病,并且已有的一些 CMT2型小鼠模型的發(fā)病年齡大多在 10月齡以后,所以Dhtkd1Tyr486*敲入小鼠模型可能尚未到出現(xiàn)明顯表型的年齡,我們期望隨著突變敲入小鼠年齡的增長(zhǎng)能觀察到更明顯的表型。

4 問(wèn)題與展望

CMT2是一種高度遺傳異質(zhì)性的疾病,目前已克隆了17個(gè)致病基因,但仍有一些CMT2的致病基因未知。隨著外顯子捕獲及二代測(cè)序技術(shù)的日益普及,相信會(huì)有更多導(dǎo)致 CMT2的致病基因被定位和克隆[41],并為突變基因致病機(jī)制的研究及臨床診治奠定基礎(chǔ)。為了從動(dòng)物水平明確CMT2的發(fā)病機(jī)制,就必須借助動(dòng)物模型開(kāi)展相關(guān)研究。目前已成功建立了近 10種 CMT2的動(dòng)物模型,并能部分模擬CMT2各亞型的臨床表型。然而,在小鼠模型構(gòu)建中也經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)小鼠模型與人類疾病表型不一致甚至不出現(xiàn)任何表型的情況,這對(duì)研究人員而言是個(gè)棘手的問(wèn)題。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是多方面的：其一,小鼠和人類基因組雖然同源性極高,但同源性畢竟未達(dá)到100%,尤其在信號(hào)傳導(dǎo)、生理生化方面仍存在很多差異; 其二,機(jī)體發(fā)育過(guò)程中其他基因的補(bǔ)救或代償作用可以減弱甚至消除某一突變基因的致病效應(yīng); 其三,在基因工程小鼠構(gòu)建過(guò)程中,引入單個(gè)點(diǎn)突變的同時(shí)也會(huì)引入 neo等篩選標(biāo)記。雖然多數(shù)情況下篩選標(biāo)記的引入對(duì)基因功能不會(huì)產(chǎn)生顯著影響,但有時(shí)也會(huì)對(duì)被修飾基因產(chǎn)生一些負(fù)面作用,從而很難實(shí)現(xiàn)完全自然狀態(tài)的模擬[28]。為此,在CMT2小鼠模型建立時(shí)必須充分考慮上述因素的影響,并采取相應(yīng)的應(yīng)對(duì)策略。

已知 CMT2是一種神經(jīng)源性肌肉疾病,涉及到軸索的長(zhǎng)距離運(yùn)輸。由于人類與小鼠在體型及解剖結(jié)構(gòu)方面存在一定的差異,特別是人類軸索延伸至下肢的距離相比小鼠的距離要長(zhǎng),因此突變對(duì)小鼠下肢肌肉的影響可能會(huì)較小,病變程度也可能較輕。近年來(lái)對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的研究還發(fā)現(xiàn)微環(huán)境在CMT2發(fā)病過(guò)程及疾病進(jìn)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。攜帶突變基因的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元通?？稍谒ダ霞把装Y環(huán)境的誘導(dǎo)下發(fā)生病變,而病變后的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元又反過(guò)來(lái)使得微環(huán)境及膠質(zhì)細(xì)胞更加惡化,這樣疾病逐漸發(fā)展[42]。為進(jìn)一步研究CMT2的發(fā)病機(jī)制,還需要構(gòu)建更多在時(shí)間和空間方面能得到控制的CMT2小鼠模型。

科學(xué)工作者開(kāi)展CMT2研究的目的都是為了人類健康,然而到目前為止,還沒(méi)有一項(xiàng)研究專門側(cè)重于尚未出現(xiàn)CMT2癥狀的年輕人的心理健康。國(guó)際遺傳顧問(wèn)協(xié)會(huì)(NSGC)和美國(guó)人類遺傳協(xié)會(huì)(ASHG)發(fā)起在兒童中檢測(cè)成年期發(fā)病的活動(dòng),目的就是為兒童提供更好的照顧。該項(xiàng)活動(dòng)側(cè)重于病人自發(fā)的、符合法律規(guī)定的檢測(cè),所有先證者和家人都應(yīng)考慮到醫(yī)療、社會(huì)、心理和生殖問(wèn)題。對(duì)于CMT而言,無(wú)癥狀或癥狀不明顯的兒童不會(huì)從確診為CMT疾病中獲得任何好處,變幻莫測(cè)的疾病發(fā)展趨勢(shì)以及缺乏預(yù)防保健意識(shí)無(wú)疑對(duì)兒童的未來(lái)生涯和人生規(guī)劃產(chǎn)生巨大挑戰(zhàn)。因此早期診斷可以提前阻止疾病的發(fā)生并且提供長(zhǎng)期的護(hù)理保障,這對(duì)于兒童未來(lái)的生活將會(huì)產(chǎn)生巨大益處[7]。

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