江香梅,伍艷芳,肖復明,熊振宇,徐海寧

江西省林業(yè)科學院,國家林業(yè)局樟樹工程技術(shù)研究中心,南昌 330032

樟樹(Cinnamomum camphora(L.) Presl)是我國特有國家Ⅱ級保護樹種,是集材用、藥用、香料、油用、化工、觀賞、生態(tài)環(huán)境和生態(tài)文化建設(shè)等于一體的多用途樹種,可作為樟科的代表種,具有極重要的開發(fā)利用價值[1]。樟樹的化學成分復雜多樣,其根、莖、葉、花、果中均富含精油,從其精油中已鑒定出 150余種化合物,且新化合物還在不斷被鑒定出來。我國是世界上生產(chǎn)樟油最多的國家,其產(chǎn)量占世界的 80%,產(chǎn)品質(zhì)量享譽全球。樟樹按葉精油主要化學成分種類及含量的不同,可分為芳樟(精油中主成分為芳樟醇,下同)、腦樟(樟腦)、油樟(1,8-桉葉油素)、異樟(異-橙花叔醇)和龍腦樟(右旋龍腦)5種主要化學類型[2]。迄今為止,對樟樹精油化學成分分析與利用的研究較多[3～5],而對化學成分代謝途徑的研究則較少[6,7]。目前,以樟樹為代表的樟科植物尚未完成全基因組測序,EST文庫尚未建立,GenBank上樟樹EST序列也較少,相關(guān)基因的功能注釋亦不完善,給樟樹萜類化合物次生代謝途徑的研究帶來極大困難,亟需更多的基因組或轉(zhuǎn)錄組信息來解決這一問題。

新一代測序技術(shù)(Next-generation sequencing technologies,NGSTs)對分子生物學的發(fā)展起到了巨大的推動作用。其中用于轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)字基因表達譜(Digital gene expression profiling,DGE)研究的RNA-seq技術(shù)不僅能夠廣泛應(yīng)用于有參考基因組序列的物種研究,如水稻(Oryza sativa)[8]、葡萄(Vitis vinifera)[9]、黃瓜(Cucumis sativus)[10]等,也能應(yīng)用于無參考基因組序列的物種,如青蒿(Artemisia annua)[11]、人參(Panax ginseng)[12]、紅豆杉(Taxus mairei)[13]、羅漢果(Siraitia grosvenorii)[14]等,應(yīng)用較為廣泛[15]?；谵D(zhuǎn)錄組測序得到的基因功能注釋、蛋白編碼區(qū)注釋等大量的信息,可以從基因的表達水平[9,13]、SNP鑒定[11,16]、SSR分子標記篩選[17,18]、候選基因的挖掘[19,20]、融合轉(zhuǎn)錄本的表達[8,21]、可變剪接[8,22]等方面展開相關(guān)研究,并建立相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[17],為進一步研究提供重要基礎(chǔ)。本研究采用 Illumina HiSeq? 2000新一代高通量測序技術(shù)對樟樹5種化學類型葉片轉(zhuǎn)錄組進行測序,對測序得到的大量Unigene進行GO、COG和KEGG分類統(tǒng)計,給出功能注釋和Pathway注釋,并預測Unigene蛋白CDS。這些注釋信息的完成將為樟樹精油主要成分合成、功能基因及相關(guān)候選基因的發(fā)掘提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時也為進一步克隆功能基因全長、研究基因功能奠定了基礎(chǔ),對推動我國樟科植物分子生物學研究將起到極大促進作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料采自江西省林業(yè)科學院內(nèi)年齡約 30年的樟樹成年植株。于4月底統(tǒng)一采集腦樟、芳樟、油樟、異樟、龍腦樟 5種化學類型幼嫩葉片,液氮速凍后-70℃低溫保存,用于提取RNA,測序。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、純化和文庫構(gòu)建

采用通用植物總RNA提取試劑盒RNeasy Plant Mini Kit提取樟樹5種化學類型葉片總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,Agilent 2100 Bioanalyzer檢測總 RNA 濃度。用 Oligotex? mRNA kit(TaKaRa)分離純化 mRNA。得到的 mRNA采用fragmentation buffer打斷成小片段,經(jīng)過PCR擴增,建立小片段測序文庫。文庫測序采用 Illumina Hi-Seq? 2000完成。

1.2.2 序列拼接

測序后得到的Raw reads,去除含有帶接頭的、重復的(N>5%)、測序質(zhì)量很低的reads(質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個 reads的 20%以上),獲得 Clean reads。采用短 reads組裝軟件 Trinity[23]做轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。先將具有一定長度overlap的reads連成更長的片段,得到Contig組裝片段,再將reads比對回Contig,通過 paired-end reads來確定來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig以及這些Contig之間的距離,將這些 Contig連在一起,得到兩端不能再延長的序列,即為Unigene。

1.2.3 功能注釋和CDS預測

功能注釋信息給出Unigene的蛋白功能注釋、COG功能注釋。先通過BlastX將Unigene序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫 Nr(NCBI非冗余蛋白庫)、SwissProt(去冗余的蛋白數(shù)據(jù)庫)、KEGG(系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫)和 COG(對基因產(chǎn)物進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫)(E值<1e-5),再通過 BlastN將Unigene比對到核酸數(shù)據(jù)庫 Nt(NCBI非冗余核酸數(shù)據(jù)庫)(E值<1e-5),得到跟給定 Unigene具有最高序列相似性的蛋白,從而得到該 Unigene的蛋白功能注釋信息。采用 Blast2GO軟件[24],根據(jù)Nr注釋信息得到 GO注釋信息; 采用 WEGO軟件[25]對 All-Unigene(按分子功能、細胞組分、生物學過程)進行GO功能分類統(tǒng)計,從宏觀上認識樟樹的基因功能分布特征。具體測序數(shù)據(jù)分析參照林萍等[26]的轉(zhuǎn)錄組注釋分類方法。將 Unigene序列按 Nr、SwissProt、KEGG和 COG的優(yōu)先級順序做BlastX比對(E值<1e-5)。取比對結(jié)果中rank最高的蛋白確定該 Unigene的編碼區(qū)序列,根據(jù)標準密碼子表將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列,從而得到該Unigene編碼區(qū)的核酸序列(序列方向5′→3′)和氨基酸序列。與 4個數(shù)據(jù)庫皆比對不上的Unigene用ESTscan[27]軟件預測其編碼區(qū),得到其編碼區(qū)的核酸序列(序列方向5'→3')和氨基酸序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟樹5種化學類型葉片轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)量

樟樹 5種化學類型葉片轉(zhuǎn)錄組測序后得到的Raw reads及去除雜質(zhì)之后的Clean reads結(jié)果列于表1。由表1可以看出,質(zhì)量參數(shù)Q20最低為95.08%(異樟),最高達到 98.51%(腦樟); 過濾后不確定的堿基比例N值≤0.01%; 5種化學類型的GC含量在46.55%～49.29%之間。

2.2 樟樹5種化學類型葉片轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量

2.2.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用短reads組裝軟件Trinity從頭組裝的樟樹5種化學類型序列重疊群Contig和Unigene數(shù)目列于表 2。由表 2可知,經(jīng)過拼接最終獲得長度在 100～2 000 bp之間的Unigene 156 278個,總長87.09 Mb,序列平均長度584 bp,N50為1 023 bp。

表1 測序產(chǎn)量統(tǒng)計表

表2 組裝質(zhì)量統(tǒng)計表

2.2.2 Contig和Unigene的長度分布

Contig和Unigene的長度分布分別見圖1和圖2。樟樹All-Unigene長度在100～500 bp的有114 115個,占73.02%; 500～1 000的有18 316個,占11.72%;1 000～1 500的有9 144個,占5.85%; 1 500～2 000的有6 365個,占4.07%; ≥2 000的有8 338個,占5.34%。

2.3 Unigene的功能注釋

2.3.1 注釋結(jié)果統(tǒng)計

分別將 Unigene注釋到 Nr、Nt、SwissProt、KEGG、COG、GO庫,并分別對注釋到每個庫以及所有注釋上的Unigene數(shù)目進行統(tǒng)計,結(jié)果見表3。通過Blast搜索比對,共有55 955條Unigene獲得了基因注釋,占All-Unigene的35.80%; 有100 323條Unigene(64.20%)未被注釋。Nr數(shù)據(jù)庫比對注釋的信息最多,注釋了55 257條Unigene,COG注釋的信息最少,僅21 806條Unigene得到了注釋。

2.3.2 Unigene的COG分類

為了進一步評價轉(zhuǎn)錄組文庫的完整性和注釋的有效性,對Unigene進行了COG分類(圖3)。在COG 25個類別中,“一般功能基因”為最大 5的組(7 466,34.24%),其次是“轉(zhuǎn)錄”(4 955,22.72%)和“復制、重組和修復”(3 803,17.44%)。3個最小的組別分別為“核苷酸結(jié)構(gòu)”(2,0.01%)、“細胞外結(jié)構(gòu)”(11,0.05%)和“RNA 加工與修飾”(358,1.64%)。此外,參與次生代謝生物合成、運輸和分解的有 1 296個Unigene,占5.94%。

2.4 Unigene的GO分類

在已經(jīng)得到的 Nr注釋信息基礎(chǔ)上,采用Blast2GO獲得樟樹Unigene的GO分類信息,共有24 717條Unigene得到GO注釋。在GO分類體系中,生物學過程、細胞組分和分子功能 3個大的類別被劃分為詳細的 44個小的類別,其中“細胞”(16 006,14.52%)、“細胞要素”(14 515,13.17%)和“細胞器”(11 547,10.48%)3個類群占了主要部分,隨后是“催化活性”(11 074,10.05%)、“結(jié)合活性”(10 642,9.65%)和“代謝過程”(9 930,9.01%)3 個類群,而“細胞殺傷”(1,0.001%)、“律動過程”(2,0.002%)和“氮素利用”(3,0.003%)僅有非常少的基因歸入,這一分類結(jié)果顯示了樟樹葉基因表達譜的總體情況(圖4)。

2.5 KEGG pathways分析

圖1 Contig的長度分布統(tǒng)計圖

利用KEGG數(shù)據(jù)庫進行了功能分類和Pathway注釋[28]。首先,將156 278條All-Unigene采用BlastX比對到KEGG數(shù)據(jù)庫,結(jié)果有48 875條序列能夠比對上(E值<1e-5),共有32 885條Unigene能夠注釋到217個KEGG標準Pathway,另外123 393條序列則沒有相應(yīng)的生物學 Pathway注釋(Condition:expect≤1e-5; rank≤5),選取注釋基因比例大于1%(占所有注釋基因)的Pathway列于表4。由表4可知,注釋到“代謝途徑”中的Unigene最多,有7 808條,占23.74%; 有3 350條基因(10.19%)注釋到次生代謝生物合成途徑,其中,參與單萜[PATH:ko00902](66,0.2%)、二萜[PATH:ko00904](113,0.34%)、倍半萜[PATH:ko00909](34,0.1%)和萜類骨架合成[PATH:ko00900](211,0.24%)的Unigene共424個。參與不飽和脂肪酸生物合成的 Unigene有 191條,占0.58%。這些有代表性的注釋為研究樟樹特殊生物學進程、功能和代謝提供了重要依據(jù)。

圖2 Unigene的長度分布統(tǒng)計圖

2.6 Unigene的編碼蛋白框(CDS)預測

將 Unigene序列按 Nr、SwissProt、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫的優(yōu)先級順序分別做BlastX比對(E值<1e-5),確定該 Unigene的編碼區(qū)序列,然后根據(jù)標準密碼子表將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列,從而得到該Unigene編碼區(qū)的核酸序列(序列方向 5′→3′)和氨基酸序列。最后,跟以上 4個數(shù)據(jù)庫皆比對不上的Unigene用ESTscan軟件預測其編碼區(qū),得到其編碼區(qū)核酸序列(序列方向為 5′→3′)和氨基酸序列。圖 5分別顯示All-Unigene與數(shù)據(jù)庫Blast的CDS核酸和氨基酸序列分布,ESTscan預測編碼區(qū)的核酸和氨基酸序列的長度分布。

表3 Unigene注釋結(jié)果統(tǒng)計表

2.7 樟樹芳樟醇合酶基因在不同化學類型中的表達模式分析

樟樹5種化學類型精油的主要成分為萜類物質(zhì),且多數(shù)為單萜和倍半萜類。在 Pathway單萜合成的代謝通路中,找到9條Unigene可能編碼樟樹芳樟醇合成途徑的關(guān)鍵酶芳樟醇合酶基因,它們在 5種化學類型中的表達水平(Reads Per kb per Million reads,RPKM值)見表5。表5顯示,芳樟醇合酶基因在芳樟中優(yōu)勢表達,而在油樟中表達水平較低。這些Unigene的注釋信息將為進一步克隆功能基因的全長、研究其功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為樟樹精油的代謝調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

圖3 Unigene的COG分類圖

圖4 Unigene的GO分類圖

表4 KEGG pathway注釋結(jié)果統(tǒng)計表

3 討 論

轉(zhuǎn)錄組是功能基因組研究的一個重要功能指標[29]。本研究首次采用 Illumina高通量測序技術(shù)對樟樹 5種化學類型葉片轉(zhuǎn)錄組進行測序,共拼接得到156 278條Unigene。其中,未獲得鑒定的新Unigene 100 323條,占總數(shù)的64.20%,為進一步挖掘并鑒定新的功能基因提供了豐富的數(shù)據(jù)信息。本研究測序所得到的Unigene序列平均長度584 bp,N50為1 023 bp,完全滿足轉(zhuǎn)錄組測序的要求。傳統(tǒng)的基因表達序列標簽(Expressed sequence tags,ESTs)技術(shù)被認為是一種研究轉(zhuǎn)錄組的有效方法,廣泛應(yīng)用于新基因發(fā)現(xiàn)、基因表達分析和蛋白質(zhì)組學?；蛐酒?Gene chip)技術(shù)也廣泛用于大量核酸分子的檢測分析,為研究不同層次多基因協(xié)同作用提供手段。與EST 技術(shù)及基因芯片技術(shù)相比,基于 Illumina HiSeqTM2000 高通量測序?qū)D(zhuǎn)錄組進行比較和分析,所需的RNA量較少,背景噪音比基因芯片低,繪制轉(zhuǎn)錄組遺傳圖譜所需的費用更低。該平臺可同時用于有(無)參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測序,通過短序列組裝軟件Trinity獲得的信息量完全可滿足研究需求。

木本植物由于多數(shù)為異交物種,雜合性較強,基因組相對較大且較為復雜,從而導致遺傳背景研究相對滯后。而對于遺傳背景不清晰的木本植物,可先采用高通量測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序,以獲得的大量 Unigene信息構(gòu)建遺傳和物理圖譜,為待測序的物種提供遺傳背景信息[31]。林萍等[27]曾采用Illumina的Solexa技術(shù)對普通油茶種子4個發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組進行測序,經(jīng)組裝分析獲得 80 310 條Unigene,其中確定編碼蛋白功能的有 21 789 條,占All-Unigene 的27.13%。本研究中,Unigene注釋結(jié)果顯示共有 55 955條 Unigene獲得了基因注釋,占 All-Unigene的 35.80%,略高于油茶轉(zhuǎn)錄組的注釋,但是相對于草本植物來說注釋結(jié)果偏低,表明現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中,樟科植物基因注釋信息量極為缺乏。樟樹作為樟科植物的代表樹種,其轉(zhuǎn)錄組測序及相關(guān)注釋具有極為重要的意義,將為樟科其他物種提供注釋信息參考。高通量測序技術(shù)可以大規(guī)模的對生物體組織樣本進行測序分析,有利于建立特定時空條件下的物質(zhì)代謝途徑[29]。Sun等[19]對西洋參(Panax quinquefoliusL.)轉(zhuǎn)錄組進行測序,KEGG分析確定有 4 097條序列被定位到特定的代謝途徑中,并且初步確定了從 acetyl CoA開始經(jīng)過類異戊二烯途徑的所有參與人參皂苷骨架合成的酶。此外,東北紅豆杉(Taxus cuspidataSieb.et Zucc.)中的紫杉醇[32]、蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.ex Murray)Trev.)和龍骨馬尾杉(Phlegmariurus carinatus(Desv.ex Poir.) Ching.)中的石松生物堿[33]等物質(zhì)也通過高通量測序進一步確定其次生代謝途徑。樟樹Unigene的GO分類結(jié)果顯示了樟樹5種化學類型葉基因表達譜的總體情況,共有24 717條Unigene得到GO注釋,在 44個小類別中,歸入“細胞”和“細胞器”類別的分別為 16 006(14.52%)和 11 547(10.48%)條Unigene,說明有較多的基因與細胞和細胞器中的生物代謝相關(guān)。KEGG pathways分析結(jié)果表明,共有3 350(10.19%)條基因注釋到次生代謝生物合成途徑,其中,參與萜類代謝的Unigene共424條。在此基礎(chǔ)上進行芳樟醇合成途徑分析,結(jié)果顯示芳樟醇合酶基因在芳樟中優(yōu)勢表達,而在油樟中表達水平較低,這一結(jié)果與樟樹 5種化學型中芳樟醇的含量高低相一致[2]。這些有代表性的注釋為研究樟樹次生代謝過程、脂肪酸合成途徑及其他特殊生物學進程提供了重要依據(jù)。

圖5 CDS的長度分布統(tǒng)計圖

表5 編碼芳樟醇合酶的Unigene注釋結(jié)果統(tǒng)計表

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