洪成雨 鄭 建 李 婷

代謝活動和環(huán)境因素(如紫外線)對機體的每個細胞每天的分子損害500，000處之多。DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)是一個高度保守的信號感應過程，其必須快速頻繁的運行，來修復DNA結構上的任何錯誤之處。DDR信號通路被看作是機體的一道抗癌屏障，如通路中有信號分子發(fā)生突變或調控異常，細胞染色體的不穩(wěn)定性將會增加，自穩(wěn)失衡，增殖失控，促成腫瘤的發(fā)生。我們通過研究其通路中p-ATM、p-p53、p21信號分子與胃癌化療療效的相關性，為DNA損傷在進展期胃癌發(fā)生發(fā)展進程中可能存在的作用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月至2011年10月我院收治并經(jīng)病理學檢查證實為進展期胃癌患者52例，其中男性28例，女性24例，年齡 42～76歲，平均(58.3±7.2)歲?；颊呔形赴└涡g，按WHO制定的標準進行術后病理組織學分型:高分化腺癌9例，中分化腺癌13例，低分化腺癌22例，黏液腺癌8例。納入標準:未發(fā)生肺臟、肝臟、腦、骨等器官的遠處轉移;既往未接受過抗腫瘤治療以及化療;無化療和手術禁忌癥;病史資料完整;術后均采用FOLFOX方案化療4個周期。

1.2 主要試劑

p-ATM為鼠抗人單克隆抗體、p-p53為兔抗人多克隆抗體，均購自美國Cell Signaling Technology公司，p21為兔抗人多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，廣譜S-P試劑購自福建邁新技術公司。

1.3 治療方法

入選患者均采用FOLFOX方案化療:奧沙利鉑130 mg/m2，第1天，靜脈滴注3 h;亞葉酸鈣200 mg/m2，第1～2天，靜脈滴注 1 h;5-氟尿嘧啶，2400 mg/m2，靜脈持續(xù)泵入46 h。3周為1個周期，完成4個周期后判定療效。按WHO實體瘤近期客觀療效標準進行療效評估，分為未進展和進展，未進展為治療有效，進展為治療無效。記錄并觀察所有患者從首次化療至病情進展或死亡的時間。隨訪截止日期為2012年11月10日。

1.4 免疫組化染色

所有標本均經(jīng)10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋組織并切片，HE染色，采用免疫組化SP法，正常羊血清室溫封閉10 min，加鼠抗人一抗于4℃過夜，PBS沖洗后加兔抗鼠二抗于室溫下作用30 min，PBS沖洗3×5 min。DAB顯色反應，自來水充分沖洗終止反應，沖洗后蘇木精復染、脫水、封固。用已知的陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5 結果判斷方法

p-ATM、p-p53及p21蛋白陽性著色均分布于細胞核，每張切片選擇10個典型的高倍視野(×400)，計數(shù)至少1000個細胞，結果以陽性細胞百分比計算，陽性細胞率≥10%為陽性(+)，＜10%為陰性(－)。

1.6 統(tǒng)計分析

應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用t檢驗、χ2檢驗、確切概率法及Pearson相關分析法，采用Kapan-Meier生存分析法分析無病生存期。

2 結果

2.1 p-ATM、p-p53及p21表達與胃癌臨床病理特征的關系

p-ATM陽性著色分布癌細胞核，52例胃癌組織中p-ATM陽性表達率為36.54%，p-ATM表達與患者性別、年齡無關(P＞0.05)，p-ATM表達與胃癌病理類型、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期顯著相關(P＜0.05)。p-p53陽性著色分布于癌細胞核，52例胃癌組織中陽性表達率為61.54%，p-p53表達與患者性別、年齡、病理類型、浸潤深度無關(P＞0.05)，與淋巴結轉移、TNM分期顯著相關(P＜0.05)。p21陽性著色分布于癌細胞核，52例胃癌組織中其陽性表達率為36.54%，其表達與患者性別、年齡、浸潤深度無關(P＞0.05)，而與其病理類型、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期顯著相關(P＜0.05)，見表1。

表1 p-ATM、p-p53及p21表達與胃癌臨床病理特征的關系(例，%)

2.2 p-ATM、p-p53及p21表達與其療效的關系

52例初治進展期胃癌患者化療4個療程后進行觀察，有效34例，無效18例，p-ATM陽性表達者治療有效率為84.21%，p-ATM陰性表達者治療有效率為51.52%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。pp53陽性表達者治療有效率為56.25%，p-p53陰性表達者治療有效率為80.00%，兩者比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。p21陽性表達者治療有效率為78.95%，p21陰性表達者治療有效率為57.58%，兩者比較無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表2。

表2 p-ATM、p-p53和p21表達與胃癌患者療效的關系/例

2.3 p-ATM、p-p53及p21表達與胃癌患者無進展生存期的關系

52例進展期胃癌患者中位PFS為7個月，其中p-ATM陰性者中位PFS為6個月，p-ATM陽性者中位PFS為8個月，兩者PFS比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖1a。p-p53陰性者中位PFS為8個月，pp53陽性者中位PFS為7個月，兩者PFS比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1b。p21陰性者中位PFS為6個月，p21陽性者中位PFS為8個月，兩者PFS比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖1c。

圖1 p-ATM、p-p53、p21表達對化療PFS的影響

2.4 p-ATM、p-p53及p21表達間的相關性

本組中p-ATM表達與p21表達呈正相關，p21表達與p-p53表達呈負相關(P＜0.05)，p-ATM表達與p-p53表達無相關性。

3 討論

3.1 磷酸化蛋白的意義

DNA損傷是指在復制過程中DNA核苷酸序列發(fā)生了永久性改變，并導致了遺傳特征改變的現(xiàn)象。損傷類型包括:堿基結構的改變、分子間的交聯(lián)、單鏈斷裂、雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)［1-3］。p-ATM(Phospho-ATM(ser1981)protein)是Ser1981磷酸化的ATM(ataxia telangiectasia mutated kinase)蛋白，ATM主要感應和識別各種內外源性誘變因子造成的DSBs［4-5］。DSBs能夠促使ATM發(fā)生自動磷酸化進而快速激活ATM 激酶［6-7］，所以p-ATM(ser1981)的表達水平與DSBs損傷的情況具有相關性。p-p53(Phosphop53(ser15)protein)是Ser15磷酸化的p53蛋白。當細胞應激或受損時p53被活化，為DNA損傷修復贏得時間，修復失敗則促進細胞凋亡，避免細胞發(fā)生惡性轉化。p53蛋白在DDR中作為調控分子，在損傷修復和凋亡誘導途徑中均發(fā)揮重要作用。p21基因與細胞凋亡關系密切，p21在DNA損傷時，使生長周期停滯，DNA 修復，保護細胞免受凋亡［8］。

3.2 磷酸化蛋白表達與胃癌化療療效的相關性

我們主要通過免疫組化方法對p-ATM、p-p53、p21與胃癌化療療效的相關性的研究，探討三者在DNA損傷修復過程中可能存在的作用。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，p-ATM、p-p53和p21在胃癌組織中的陽性表達率分別為36.54%、61.54%和36.54%。經(jīng) Pearson 相關分析結果顯示，p-ATM表達與p21表達呈正相關，p21表達與p-p53表達呈負相關，p-ATM與p-p53表達無相關性。DNA損傷后激活ATM激酶，ATM快速磷酸化p53，繼而通過p21誘導G1期阻滯。

3.3 磷酸化蛋白表達與臨床病理特征的相關性

我們的實驗數(shù)據(jù)顯示，化療后DNA損傷情況嚴重，p-ATM與p21高表達，p-p53表達較弱。提示，細胞中可能存在一條通路，其不依賴于p53直接由ATM介導的 p21活化的快速反應［9-10］。p-ATM、p-p53和p21的陽性率與患者年齡、性別無明顯相關性(P＞0.05)，而p-ATM陽性著色位于癌細胞核與腫瘤的浸潤深度、組織學分化程度、胃癌的淋巴結轉移及TNM分期有顯著相關性(P＜0.05)。p-ATM與p21在低分化腺癌類型、浸潤未及漿膜、無淋巴結轉移、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期)高表達，p21陽性著色位于癌細胞核中。p-p53陽性著色位于癌細胞核中，且隨著淋巴結轉移以及TNM分期的增加，表達陽性率也明顯升高。說明炎癥浸潤程度與DNA損傷存在相關性，炎癥可能加速癌變進程［11］。本實驗52位患者均行4個療程FOLFOX方案化療，在此基礎上檢測p-ATM、p-p53和p21與進展期胃癌化療療效的關系。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，化療后臨床療效有效者34例，無效者18例，胃癌組織中p-ATM和p21在陽性表達初治進展期胃癌患者的治療有效率均顯著高于陰性表達者治療有效率，p-p53陰性表達者治療有效率為80.00%，p-p53在陰性表達初治進展期胃癌患者的治療有效率均顯著高于陽性表達者。人類腫瘤組織中常伴隨DSBs的積累［12］，而p-ATM(ser1981)的表達水平可反映DSBs損傷水平。由此推論，在進展期胃癌中也存在DNA DSBs損傷的積累，且ATM和p21蛋白的活化促使了DNA損傷的修復。

3.4 磷酸化蛋白表達與化療后生存期的相關性

本組研究中，中位生存期為7個月，其中p-ATM和p21陰性者中位PFS為6個月，ATM陽性者中位PFS為8個月。經(jīng)單因素Kaplan-Meier生存分析，結果顯示p-ATM和p21陽性者的PFS優(yōu)于陰性者，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而p-p53陰性者的PFS優(yōu)于陽性者(P＜0.05)。推測，在胃癌患者化療后DNA發(fā)生損傷，p-ATM和p21可使受損DNA得到修復，再加上綜合治療來提高患者的生存期。

綜上所述，本研究得出如下結論:ATM、p53、p21信號通路對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能具有極為重要的作用，可進一步深入研究。

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