楊 藝，普 燕，張富春

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源與基因工程重點實驗室，新疆，烏魯木齊，830046)

隨著乳品行業(yè)的高速發(fā)展，人們對發(fā)酵乳制品的需求也日益增加。近年來國內外干酪市場發(fā)展迅猛，不僅對干酪的研究日益深入，而且制作干酪所用的凝乳酶需求量大增。干酪加工中添加凝乳酶的主要目的是促使牛乳凝結，為排除乳清提供條件［1］。凝乳酶是一種從未斷奶的小牛皺胃中發(fā)現(xiàn)的天門冬氨酸蛋白酶，可以專一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵，破壞乳中的酪蛋白膠束引起蛋白質凝聚，因此在乳制品尤其是在干酪加工制作中應用廣泛［2］，理想的凝乳酶應能迅速、專一地打開κ-酪蛋白Phe105-Met106鍵，但水解蛋白其他肽鍵的能力較低，即兩者的活力比值要高［3］。凝乳酶凝乳后制成的干酪相當于將原料奶中的蛋白質和脂肪濃縮了十倍左右，另外干酪中還含有糖類、有機酸、常量礦物質元素等多種成分，具有很高的營養(yǎng)價值。凝乳酶主要為動物來源的凝乳酶，約占市場的70%，同時還有植物來源的凝乳酶、微生物來源的凝乳酶和利用基因工程技術生產的重組凝乳酶。牛凝乳酶有著強大的凝乳活性和較低的蛋白水解活性，是凝乳制作干酪的優(yōu)質酶，目前對牛凝乳酶的研究已經較為成熟，市場上銷售的凝乳酶主要是牛凝乳酶，而相應駱駝凝乳酶研究較少，因此駱駝凝乳酶開發(fā)利用前景廣闊。Kappeler等［4］研究發(fā)現(xiàn)單峰駝凝乳酶與牛凝乳酶有不同的特性，單峰駝凝乳酶表現(xiàn)出比牛凝乳酶高70%的凝乳活性，卻只有牛凝乳酶的20%非特異性蛋白酶活性。動力學分析表明，達到半飽和時，其所需的底物僅是牛凝乳酶的50%還少，并且牛凝乳酶不能凝結駱駝乳，說明駱駝凝乳酶有較高的凝乳活性。Jensen等［5］研究表明單峰駝凝乳酶的穩(wěn)定性高于牛凝乳酶。

本研究主要運用生物信息學的方法對雙峰駝凝乳酶基因及相應的氨基酸序列的同源性、理化性質、保守結構域、亞細胞定位、信號肽、跨膜結構域、親水性/疏水性、二級結構以及活性位點進行預測分析。旨在為研究雙峰駝凝乳酶的凝乳特性及其條件提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 雙峰駝凝乳酶原基因序列的獲得

首先從Broe［6］等人在2011申請的專利中獲得雙峰駝凝乳酶原基因序列，由上海生工生物工程有限公司合成雙峰駝凝乳酶原基因開放閱讀框序列，在大腸桿菌進行原核表達，發(fā)現(xiàn)雙峰駝凝乳酶原融合蛋白以包涵體形式表達，分子大小與理論值相符。將雙峰駝凝乳酶原融合蛋白包涵體溶于尿素，但透析復性的雙峰駝凝乳酶原融合蛋白經過酸化/中和處理并沒有得到有活性的凝乳酶，說明該基因序列所產生的雙峰駝凝乳酶原有誤。隨后通過檢索GeneBank數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)Kappeler等人正式注冊的雙峰駝凝乳酶原基因序列，與從專利獲得的序列比對后，發(fā)現(xiàn)兩者雙峰駝凝乳酶原有六個氨基酸的差異，推測可能是這六個氨基酸的差異導致合成的凝乳酶無活性。本研究采用從GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲得的雙峰駝凝乳酶原基因序列進行分析。

1.2 生物信息學分析

利用 NCBI及 ProtParam、ProtScale、SignalP 4.0 Server、TMHMM2.0、等在線工具進行核酸及氨基酸序列的組成、理化性質、信號肽和親水性/疏水性分析;利用Blast和DNAMAN在線工具以及MEGA4.0軟件，進行氨基酸序列的序列比對和同源性分析。所用軟件或在線工具有關信息見表1。

表1 預測基因結構和功能應用的網站及軟件Table 1 The websites and softwares for predicting the gene structure and function

2 結果與分析

2.1 雙峰駝凝乳酶原基因序列

雙峰駝凝乳酶原基因序列是一個完整的開放閱 讀框，為1 146 bp，編碼381個氨基酸(見圖1)。

圖1 雙峰駝凝乳酶原序列及其氨基酸序列Fig.1 Nucleotide acid sequence and amino acid sequence of prochymosin in camelus bactrianus

2.2 雙峰駝凝乳酶原的同源性分析

通過GeneBank數(shù)據(jù)庫中的Blastp程序，對雙峰駝凝乳酶的氨基酸序列進行同源性分析，數(shù)據(jù)顯示其與單峰駝，牦牛、牛、山羊、印度水牛、綿羊凝乳酶氨基酸序列相似性分別為99%、84%、84%、84%、83%和84%。利用DNAMAN軟件對雙峰駝凝乳酶原的氨基酸序列和其它物種凝乳酶原的氨基酸序列進行多重比對(見圖2)。運用MEGA4.0軟件，根據(jù)上述動物的凝乳酶原的氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹(見圖3)，進一步的驗證了其同源性。

圖2 雙峰駝凝乳酶原以及其它動物種凝乳酶原的基氨基酸序列比對Fig.2 Homology analysis of camelus bactrianus prochymosin amino acid sequences and those from other animal species

圖3 不同物種基于凝乳酶原氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of different species basedon amino acid of prochymosin in camelus bactrianus

2.3 雙峰駝凝乳酶原氨基酸一級結構及理化性質預測分析

通過ExPASyProtParam預測雙峰駝凝乳酶原基因編碼的氨基酸序列的組成和理化性質，并與單峰駝、牛等動物凝乳酶原基因的一級結構進行比較，結果見表2。結果顯示，凝乳酶原基因均編碼381個氨基酸，并且其帶正、負電荷氨基酸數(shù)目相差甚微，分子量差異很小，等電點在4.8到5.9之間，其半衰期均大于10小時，表明其有較高穩(wěn)定性，根據(jù)定義當不穩(wěn)定系數(shù)分值小于40時，預測蛋白質比較穩(wěn)定;當不穩(wěn)定系數(shù)分值大于40時，則該蛋白質不穩(wěn) 定［7］，因此七種凝乳酶原均為較穩(wěn)定的蛋白。

表2 不同物種凝乳酶原的氨基酸理化性質的比較Table 2 The physical and chemical characteristics of amino acid sequences of different prochymosin

2.3 雙峰駝凝乳酶原的保守結構域分析

通過NCBI保守結構域數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Database，CDD)，分析雙峰駝凝乳酶原中的保守結構域(見圖4)，結果顯示雙峰駝凝乳酶原屬于胃蛋白酶A超家族，含有多個胃蛋白酶保守結構域。

圖4 預測的雙峰駝凝乳酶原保守結構域Fig.4 Conserved domain prediction of prochymosin in camelus bactrianus

2.4 雙峰駝凝乳酶的亞細胞定位

應用Psort工具預測雙峰駝凝乳酶的亞細胞定位，結果見表2，其可能定位于內質網(膜)、過氧化物酶體、細胞質膜和內質網(腔)。表3顯示雙峰駝凝乳酶定位于內質網(膜)的概率較高，為0.820，定位于過氧化物酶體、細胞質膜和內質網(腔)的概率甚微。

表3 雙峰駝凝乳酶原的亞細胞定位Table 3 Subcellular location of prochymosin of camelus bactrianus

2.5 雙峰駝凝乳酶原信號肽預測和分析

圖5 雙峰駝凝乳酶信號肽預測Fig.5 Signal P prediction of prochymosin in camelus bactrianus

通過Signal P4.0Server軟件預測雙峰駝凝乳酶信號肽(見圖5)，結果顯示:第17位絲氨酸殘基具有最高的原始剪切位點分值0.661，第8位亮氨酸殘基具有最高的信號肽分值0.946，第17位絲氨酸殘基具有最高的綜合剪切位點分值0.778。由于氨基酸殘基的原始剪切位點和信號肽的分值均，可推測雙峰駝凝乳酶基因所編碼的蛋白存在信號肽，屬于分泌蛋白，與Foltman關于牛凝乳酶的研究一致，該研究表明牛凝乳酶存在一個16個氨基酸組成的前導信號序列，在通過細胞膜分泌中很重要［15］。

2.6 雙峰駝凝乳酶原跨膜結構域預測和分析

跨膜結構域是膜內在蛋白與膜脂相結合的主要部位，它固著于細胞膜上起錨定作用，一般由20個左右的疏水氨基酸組成。通過Expasy軟件中的TMHMM Server v.2.0工具預測雙峰駝凝乳酶原基因的跨膜螺旋區(qū)(見圖6)。預測結果顯示，雙峰駝凝乳酶原基因氨基酸序列中不存在跨膜螺旋區(qū)，蛋白質整體381個氨基酸殘基全部在膜外，為非跨膜蛋白。

圖6 雙峰駝凝乳酶原跨膜結構域預測Fig.6 Predicted transmembrane domain of prochymosin in camelus bactrianus

2.7 雙峰駝凝乳酶原氨基酸序列的疏水性親水性的預測和分析

通過ExPASyProtScale在線軟件，對雙峰駝凝乳酶原基因所編碼的氨基酸序列的疏水性親水性進行預測，其結果見圖7，分析雙峰駝凝乳酶的結果顯示，雙峰駝凝乳酶，最高的分值3.300，為第7位的亮氨酸，疏水性最強;最低的分值-2.789，為第115和116位的精氨酸和苯丙氨酸，親水性最強。GRAVY值是測蛋質的疏水性標準，通常GRAVY值分布在2至-2之間，如為正值，則該蛋白為疏水蛋白;如為負值，則為親水蛋白。其GRAVY值為 -0.096，從整體來看，親水性氨基酸殘基的分布在整條肽鏈上，且在整體上多于疏水性氨基酸殘基，推測雙峰駝凝乳酶是一種可溶性蛋白。

圖7 雙峰駝凝乳酶原氨基酸序列的疏水性親水性預測Fig.7 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of the amino acidsequence of camelus bactrianus prochymosin

2.8 雙峰駝凝乳酶原二級結構預測和分析

蛋白質的二級結構主要包括α螺旋，延伸鏈，β轉角，無規(guī)則卷曲以及模序等蛋白質局部結構組件。通過GOR4方法對雙峰駝凝乳酶原二級結構進行在線分析(見表4，圖8)，在雙峰駝凝乳酶原二級結構中，無規(guī)則卷曲占的比例最高為53.02%，α螺旋占17.32%，延伸鏈占29.66%。由此可推測，無規(guī)卷曲是雙峰駝凝乳酶原二級結構中最大量的結構元件，α螺旋和延抻鏈分散于整個蛋白質中。

表4 雙峰駝凝乳酶二級結構典型構象統(tǒng)計結果Table 4 Secondary structure prediction of camelus bactrianus prochymosin

圖8 雙峰駝凝乳酶原二級結構預測和分析Fig.8 Predicted secondary structure of camelus bactrianus prochymosin

2.9 雙峰駝凝乳酶原的活性位點的分析

通過NPS的PROSCAN對雙峰駝凝乳酶原進行活性位點的分析(見表5)，結果顯示，雙峰駝凝乳酶原有6類活性位點，分別是N-糖基化位點、cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點、蛋白酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶II磷酸化、N–十四?；稽c、真核生物和病毒天門冬氨酰蛋白酶活性位點。這可能與凝乳酶的分泌以及自剪切成為有活性的酶等生物學功能相關。

表5 雙峰駝凝乳酶原在NPS中的活性位點預測分析Table 5 Scanning of camelus bactrianus prochymosin for site/signatures against proscan database in NPS

3 結論

駱駝乳具有多種生理活性物質，營養(yǎng)價值遠遠高于一般的動物乳制品。這些獨特成分使其在防病抗病方面起著積極的作用［16］。Jesper等研究的結果表明，單峰駝凝乳酶作為一種替代品已經被成功地銷售，因為其能提供較高的干酪產量和制備的干酪苦味少，風味很好，并且蛋白水解的活性較低［17］。Bansal N.等研究的結果表明，單峰駝凝乳酶適合用于契達奶酪的制作，不僅蛋白水解水平較低，并且具有有良好的風味［18］。目前駱駝凝乳酶研究較少，對于雙峰駝凝乳酶原基因的生物信息分析尚未見報道，因此駱駝凝乳酶開發(fā)利用前景廣闊。

本研究運用生物信息學分析軟件，系統(tǒng)地研究了雙峰駝凝乳酶原的基因序列和氨基酸序列。結果顯示，雙峰駝凝乳酶原基因全長1 146 bp，編碼381個氨基酸，屬于胃蛋白酶A超家族，可能定位于內質網(膜)的穩(wěn)定親水性蛋白，不含跨膜結構域。無規(guī)卷曲是其二級結構中最大量的結構元件，α螺旋和延抻鏈分散于整個蛋白質中，編碼蛋白有6類活性位點，主要分為N-糖基化位點，蛋白激酶磷酸化位點，蛋白酶磷酸化位點，N-十四?；稽c和蛋白酶活性位點。通過分析雙峰駝凝乳酶原基因及其編碼蛋白質的特征為研究其凝乳特性及其條件提供理論參考，對凝乳酶凝乳功能的研究具有重要的意義。

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