周琨 高曉唯 蔡巖 李文靜 胡裕坤 田麗麗 付燕

各種原因所致的角膜混濁是眼科常見的致盲眼病，角膜移植術(shù)是角膜盲患者復(fù)明的主要手段。雖然角膜移植有很高的手術(shù)成功率，但是穿透性角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生率仍然較高，而術(shù)后免疫排斥反應(yīng)是角膜移植失敗的最主要原因［1］。尤其在高危角膜移植，術(shù)后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率高達(dá)65%［2-3］。角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療已成為目前眼科領(lǐng)域亟待解決的問題。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)作為主要的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，其誘導(dǎo)免疫耐受已成為器官移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，如角膜移植、心臟移植、腎臟移植等［4］。根據(jù) DC在免疫反應(yīng)中的作用和成熟狀態(tài)不同分為:成熟樹突狀細(xì)胞(mature dendritic cells，mDC)和未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDC)，mDC 刺激免疫應(yīng)答，而imDC介導(dǎo)特異性的免疫耐受。趨化因子受體7(chemokine receptor 7，CCR7)在趨化 DC從外周組織遷移至次級(jí)淋巴器官中起關(guān)鍵作用［5-6］。本研究利用CCR7及imDC的特點(diǎn)，將含大鼠CCR7基因的腺病毒轉(zhuǎn)染修飾imDC，輸入受體體內(nèi)，觀察其對(duì)大鼠高危角膜移植免疫排斥反應(yīng)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 受體為健康清潔級(jí) SD大鼠60只，供體為健康清潔級(jí)Wistar大鼠30只，受、供體均為雄性，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物喂養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程符合ARVO有關(guān)用于研究目的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)規(guī)定。1.1.2 主要試劑 重組大鼠白細(xì)胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、重組大鼠白細(xì)胞介素-4(rrIL-4)(美國Peprotech公司);RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司);Anti-CCR7抗體(英國 Abcam公司);Ad-CCR7-EGFP 溶液:滴度 36×109PFU·mL－1、Ad-EGFP溶液:滴度 0.195×1012PFU·mL－1均購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 以60只 SD大鼠作為受體，30只Wistar大鼠作為供體，堿燒傷建立同種異體高危角膜移植模型。根據(jù)不同的處理，受體隨機(jī)分為4組，每組15只:(1)空白對(duì)照組:受體注入磷酸鹽緩沖溶液(PBS);(2)未修飾imDC組:受體注入供者源imDC;(3)imDC+腺病毒空載體組(imDC+Ad組):受體注入空載體修飾的供者源 imDC;(4)imDC+CCR7腺病毒組(imDC+Ad-CCR7組):受體注入CCR7基因修飾的供者源imDC。各組均于角膜移植術(shù)前7 d及術(shù)后3 d經(jīng)尾靜脈注入受體體內(nèi)(每只10×106個(gè)細(xì)胞懸浮于0.1 mL PBS液中，空白對(duì)照組只注入等量PBS液)。

1.2.2 大鼠骨髓源DC的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［7］的方法取Wistar大鼠骨髓進(jìn)行imDC的培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)6 d即為imDC。

1.2.3 攜帶大鼠CCR7基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染im-DC 采用文獻(xiàn)報(bào)道的離心法增強(qiáng)腺病毒轉(zhuǎn)染im-DC［8］，空白對(duì)照組為腺病毒空載體。腺病毒轉(zhuǎn)染48 h后收集imDC。通過電鏡和流式細(xì)胞儀對(duì)imDC及轉(zhuǎn)染后的imDC進(jìn)行形態(tài)學(xué)和表型鑒定。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) CCR7的表達(dá) 采用激光共聚焦顯微鏡觀察imDC及轉(zhuǎn)染Ad空載體和Ad-CCR7腺病毒后CCR7的表達(dá)情況。取培養(yǎng)好的im-DC 細(xì)胞懸液，分別經(jīng) 40 g·L－1多聚甲醛、1 g·L－1Triton、體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清、一抗(兔源性單克隆抗體CCR7，1∶250稀釋，陰性對(duì)照以 PBS代替一抗)、二抗(Tritc標(biāo)記抗兔 IgG，1∶100稀釋)及10 mg·L－1DAP染色劑I處理，少量PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液滴加在多聚賴氨酸包被的載玻片上，蓋上蓋玻片后立即用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 大鼠高危角膜移植模型的建立 參照文獻(xiàn)［7］的方法，堿燒傷誘導(dǎo)角膜新生血管，待4個(gè)象限新生血管均長入角膜中央時(shí)作為高危受體進(jìn)行角膜移植;參照 Williams等［9］方法建立大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，術(shù)前充分散瞳，用直徑3.5 mm環(huán)鉆在角膜中央鉆取植片，直徑3.0 mm環(huán)鉆制作受體植床，10-0尼龍線間斷縫合8針。

1.2.6 術(shù)后觀察及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 自術(shù)后第1天起受體大鼠每天在裂隙燈下觀察，參照Larkin等［10］的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以混濁、水腫和新生血管3項(xiàng)作為指標(biāo)，由2人同時(shí)觀察并評(píng)分，3項(xiàng)評(píng)分之和為當(dāng)日的排斥反應(yīng)指數(shù)(rejection index，RI)，當(dāng) RI≥5分時(shí)或植片混濁一項(xiàng)達(dá)到3級(jí)時(shí)視為排斥反應(yīng)發(fā)生。

1.2.7 排除標(biāo)準(zhǔn) 由于手術(shù)因素造成感染、前房出血、前房消失或術(shù)后5 d內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的角膜植片水腫、混濁或破壞以及白內(nèi)障者，予以剔除，并及時(shí)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2.8 角膜植片病理組織學(xué)觀察 于術(shù)后14 d各組隨機(jī)抽出5只大鼠處死，迅速摘除術(shù)眼取其完整角膜植片，放于40 g·L－1多聚甲醛中固定24 h，逐級(jí)脫水、置換，浸蠟，石蠟包埋后切片，行常規(guī) HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用單因素方差分析和進(jìn)一步的LSD-t檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布則采用四分位數(shù)間距表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn);以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 imDC及CCR7重組腺病毒和空載體腺病毒轉(zhuǎn)染后imDC的形態(tài)學(xué)和表型鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué) 掃描電鏡觀察見imDC呈球形或類球形，表面凹凸不平，突起較少;imDC轉(zhuǎn)染CCR7重組腺病毒和空載體腺病毒后，其表面的樹枝狀突起較imDC增多(圖1)。

Figure 1 Observation of imDC under scanning electron microscope.A:imDC group(×10 000);B:imDC+Ad group(×10 000);C:imDC+Ad-CCR7 group(×14 000)imDC掃描電鏡觀察。A:imDC組(×10 000);B:imDC+Ad組(×10 000);C:imDC+Ad-CCR7組(×14 000)

2.1.2 表型 流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果 imDC:高表達(dá)OX62(76.6%)，低表達(dá) MHC-Ⅱ (36.8%)、CD80(29.2%)、CD86(32.0%)。腺病毒轉(zhuǎn)染后 48 h，im-DC+Ad 組中 OX62、MHC-Ⅱ、CD80、CD86 的陽性率分別為 78.8%、38.9%、32.4%、34.3%。imDC+Ad-CCR7 組中 OX62、MHC-Ⅱ、CD80、CD86 的陽性率分別為 79.1% 、41.4% 、32.5% 、35.9% 。

2.2 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)CCR7的表達(dá) 細(xì)胞免疫熒光顯示imDC不表達(dá)CCR7，imDC轉(zhuǎn)染空載體腺病毒后不表達(dá)CCR7，imDC轉(zhuǎn)染CCR7腺病毒后CCR7表達(dá)增加(圖2)。

Figure 2 Expression of CCR7 by laser confocal microscope(×400).A:imDC group;B:imDC+Ad group;C:imDC+Ad-CCR7 group 激光共聚焦顯微鏡觀察CCR7的表達(dá)(×400)。A:imDC組;B:imDC+Ad組;C:imDC+Ad-CCR7組

2.3 角膜植片存活時(shí)間比較 角膜植片存活時(shí)間:空白對(duì)照組(10.44±1.88)d，imDC 組(16.00±2.18)d，imDC+Ad 組(15.11±2.03)d，imDC+Ad-CCR7組(23.67±2.83)d;4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.005，P=0.000)。與空白對(duì)照組相比，imDC組、imDC+Ad組、imDC+Ad-CCR7組角膜植片的存活時(shí)間均明顯延長(均為 P＜0.01);imDC+Ad-CCR7組較imDC組與imDC+Ad組均明顯延長(均為P＜0.01);imDC組與imDC+Ad組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.4 角膜植片評(píng)分比較 術(shù)后14 d空白對(duì)照組、imDC組、imDC+Ad組和imDC+Ad-CCR7組角膜植片的混濁(F=7.100，P=0.001)、水腫(F=7.998，P=0.000)、新生血管程度(F=7.467，P=0.000)及RI(F=7.739，P=0.000)評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與空白對(duì)照組相比，imDC組、imDC+Ad組和imDC+Ad-CCR7組角膜植片評(píng)分均明顯降低(均為 P＜0.05);與 imDC組和 imDC+Ad組相比，imDC+Ad-CCR7組角膜植片評(píng)分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05);imDC組和 imDC+Ad組角膜植片評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 HE染色 大鼠高危角膜移植術(shù)后14 d，空白對(duì)照組角膜植片顯著水腫增厚，角膜上皮細(xì)胞肥厚，基質(zhì)層板層纖維結(jié)構(gòu)紊亂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤及粗大的新生血管;imDC組植片中度水腫，基質(zhì)層板層纖維結(jié)構(gòu)輕度紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤，少量細(xì)小的新生血管形成;imDC+Ad組較imDC組水腫嚴(yán)重，基質(zhì)層板層纖維結(jié)構(gòu)紊亂及炎性細(xì)胞浸潤度較imDC組嚴(yán)重，有少量新生血管形成;imDC+Ad-CCR7組植片輕度水腫，角膜上皮細(xì)胞基本正常，基質(zhì)層板層纖維排列整齊，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，少見新生血管形成(圖3)。

Figure 3 Graft stained by HE in different groups(×200).A:Control group;B:imDC group;C:imDC+Ad group;D:imDC+Ad-CCR7 group 角膜移植術(shù)后14 d各組植片HE染色(×200)。A:空白對(duì)照組;B:imDC組;C:imDC+Ad組;D:imDC+Ad-CCR7組

3 討論

同種異體角膜移植術(shù)是目前同種異體組織移植中成功率最高的手術(shù)之一，但免疫排斥反應(yīng)仍是角膜移植面臨的重要挑戰(zhàn)，在局部或全身應(yīng)用免疫抑制劑的情況下，高危角膜移植術(shù)后角膜植片的存活率仍小于35%［11］。因此，抑制角膜移植排斥反應(yīng)是角膜移植的核心問題。

DC雖在體內(nèi)的數(shù)量較少，但其抗原遞呈能力遠(yuǎn)強(qiáng)于巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等其他APC［12］，對(duì)于誘導(dǎo)機(jī)體初始免疫應(yīng)答尤為重要。DC攝取處理周圍環(huán)境中的抗原性物質(zhì)，遷移至淋巴系統(tǒng)遞呈給T淋巴細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)。CCR7主要在幼稚T細(xì)胞、B細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面表達(dá)，在DC遷移過程中逐漸增多［13］。研究發(fā)現(xiàn)，imDC未檢測(cè)到CCR7的表達(dá)，mDC胞膜上CCR7表達(dá)上調(diào)，只有在CCR7快速增殖并同趨化因子結(jié)合之后，捕獲抗原的DC才能遷移至淋巴系統(tǒng)從而刺激免疫應(yīng)答［6］。有研究表明，通過誘導(dǎo)細(xì)胞遷移并進(jìn)入淋巴器官，CCR7有助于免疫耐受的發(fā)生［14］。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)CCR7及imDC的生物學(xué)特性，用含CCR7基因的腺病毒轉(zhuǎn)染修飾imDC，誘導(dǎo)imDC表達(dá)CCR7蛋白，使其具有遷移特性，將其通過靜脈于術(shù)前輸入受體體內(nèi)，對(duì)高危角膜移植受體進(jìn)行預(yù)處理，以期誘導(dǎo)受體對(duì)移植角膜產(chǎn)生特異性的免疫耐受而保持正常的免疫功能。

本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)得到大量imDC，通過電鏡和流式細(xì)胞儀確定其在形態(tài)和表型上均符合典型的imDC特征，表明所培養(yǎng)和誘導(dǎo)的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞。我們對(duì)空載體和CCR7基因腺病毒轉(zhuǎn)染后的imDC重新鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的imDC樹枝狀突起增多，表面分子陽性表達(dá)略微升高，說明轉(zhuǎn)染過程可能導(dǎo)致imDC趨于成熟，如何抑制轉(zhuǎn)染后imDC的成熟本課題組將深入研究。

通過對(duì) imDC、imDC+Ad和 imDC+Ad-CCR7進(jìn)行激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，imDC和imDC+Ad不表達(dá)CCR7蛋白，imDC+Ad-CCR7表達(dá)CCR7蛋白增加，表明CCR7基因有效轉(zhuǎn)入imDC且可表達(dá)蛋白。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，imDC組、imDC+Ad組和imDC+Ad-CCR7組角膜植片存活時(shí)間明顯延長，表明不同狀態(tài)的imDC通過靜脈輸注給受體，均可使其處于免疫低應(yīng)答狀態(tài)，延緩受體對(duì)移植物的免疫排斥，延長移植物的存活時(shí)間。imDC+Ad-CCR7組較imDC+Ad組存活時(shí)間明顯延長(P＜0.01)，表明供者源imDC在轉(zhuǎn)染CCR7腺病毒后，誘導(dǎo)免疫耐受的能力增強(qiáng)，可明顯提高角膜植片存活時(shí)間;imDC組與imDC+Ad組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明imDC轉(zhuǎn)染空載體后，誘導(dǎo)免疫耐受的能力并未提高。然而，CCR7基因修飾的im-DC是通過什么機(jī)制誘導(dǎo)移植物的免疫耐受目前尚不清楚，本課題組將在以后的研究中深入探討其誘導(dǎo)免疫耐受的相關(guān)機(jī)制，為其在角膜移植的臨床應(yīng)用中提供一定的基礎(chǔ)。

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