汪伊麗 黃彥天 劉增述 曹高翔 夏 薇

甲狀軟骨密切關(guān)系著生物體的飲食與語言交流等重要活動(dòng)，其損傷修復(fù)備受關(guān)注。目前國內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)上多采用傳統(tǒng)的“以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷”的治療模式，利用臨近皮瓣、帶肋骨的肌皮瓣等修復(fù)人體甲狀軟骨損傷。這種方式來源、大小形狀受限，支撐力可能不足，對人體其他組織也帶來了缺陷［1］。為此，借鑒國內(nèi)外利用HA陶瓷在牙周骨質(zhì)、藥物載體、生物硬組織等領(lǐng)域的運(yùn)用［2－3］，本組提出了一種新的甲狀軟骨支架結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和制造方法。通過CT掃描，利用CAD三維重建缺損的甲狀軟骨支架，應(yīng)用RP技術(shù)實(shí)現(xiàn)支架結(jié)構(gòu)的精確可控制造。試圖將具有良好生物相容性的羥基磷灰石生物陶瓷［4］延伸運(yùn)用于生物軟骨上，添加軟骨形成誘導(dǎo)因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2及I型膠原［5］，以期制造出近似原生物體甲狀軟骨的帶有循環(huán)微孔的人工骨架。其開孔結(jié)構(gòu)有助于軟骨生長因子和組織液的流動(dòng)循環(huán)，利于營養(yǎng)元素的交換與輸送，從而促進(jìn)新生骨的生長并與原體組織的融合［6］，力求最大限度地保留生物體的甲狀軟骨功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 羥基磷灰石(HA)，北京德科島金科技有限公司;丙烯酰胺(AM)，上海源葉生物科技有限公司;N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺(MABM)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸銨，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;過硫酸銨(APS)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;四甲基乙二胺(TEMED)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Trition－114，美國Spectrum化學(xué)試劑公司;純水;無水乙醇;水溶性I型膠原;重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2。

1.2 直接起泡法制備開孔羥基磷灰石泡沫陶瓷 按照質(zhì)量比，純水∶AM∶MABM=20∶15∶1 配制基液，實(shí)驗(yàn)中考慮到電子恒速攪拌機(jī)(額定功率為800W)的容量，取純水體積60 ml。向其中添加31.6 g羥基磷灰石制取若干組理論固相含量為16.67%的陶瓷漿料。球磨45 min，將漿料轉(zhuǎn)移至攪拌機(jī)中，加入2.5 ml起泡劑Trition－114，攪拌約8～12 min，使得漿料充分發(fā)泡，發(fā)泡后體積約為原體積的2～3倍。繼續(xù)加入過硫酸銨1.0 g，攪拌約3～5 min。最后添加催化劑TEMED約30滴(合約1.5 ml體積，采用普通膠頭滴管)，攪拌約2～3 min，由于反應(yīng)放熱，存在氣體揮發(fā)，攪拌完畢應(yīng)即時(shí)打開容器蓋。漿料反應(yīng)結(jié)束，形成具有微小孔隙的多孔泡沫坯體。

將多孔泡沫坯體室溫下放置24h風(fēng)干;其后放置爐中緩慢加熱至100～120℃，保溫24 h烘干;最后將烘干后的多孔泡沫坯體放入馬弗爐內(nèi)進(jìn)行燒結(jié):以1℃/min的速率緩慢升溫至300℃，保溫2 h;再以3℃/min的升溫速度加熱至1 200℃，保溫2 h。獲得一定孔隙率的開孔羥基磷灰石泡沫陶瓷。

1.3 羥基磷灰石泡沫陶瓷孔隙率和強(qiáng)度的測定方法 這里依據(jù)阿基米德原理，采用排液法測定羥基磷灰石泡沫陶瓷標(biāo)準(zhǔn)樣件的孔隙率。用量筒量取足量體積(V1)的無水乙醇，將準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)樣件放入其中，確保其完全浸入無水乙醇中。密封量筒，靜置數(shù)分，待樣件表面無明顯氣泡，記錄此時(shí)的量筒讀數(shù)(V2)。將樣件取出，記錄量筒中無水乙醇的讀數(shù)(V3)。則標(biāo)準(zhǔn)樣件的體積V、孔隙率K，按照下列公式進(jìn)行計(jì)算:［7］

將羥基磷灰石泡沫陶瓷切成5×5×3(單位:mm)的正方形薄片，利用電鏡對孔隙進(jìn)行電鏡掃描觀測。另將泡沫陶瓷切成標(biāo)準(zhǔn)樣件，在萬能力學(xué)測試機(jī)下進(jìn)行抗壓強(qiáng)度檢測。

1.4 凝膠注模法制備個(gè)體化泡沫陶瓷甲狀軟骨復(fù)合支架通過對生物體甲狀軟骨的CT掃描數(shù)據(jù)，CAD三維重建制備個(gè)性化的甲狀軟骨支架模具?；谏鲜龀墒斓腍A泡沫陶瓷制備技術(shù)，適當(dāng)修改HA泡沫陶瓷漿料的固相含量(體積比)，在準(zhǔn)備好的個(gè)性化甲狀軟骨支架模具內(nèi)進(jìn)行凝膠注模，脫模后即可獲得所需形狀、尺寸大小的泡沫陶瓷軟骨支架。添加重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2及Ⅰ型膠原，通過冷凍吸附法最終獲得個(gè)性化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白－復(fù)合膠原羥基磷灰石人工甲狀軟骨復(fù)合支架。

1.5 人工復(fù)合骨架應(yīng)用于動(dòng)物甲狀軟骨損傷修復(fù)的測試實(shí)驗(yàn) 培育新西蘭大白兔若干，編號后均分A、B兩組。對所有大白兔進(jìn)行甲狀軟骨缺損手術(shù)。A組術(shù)后不做其他處理。B組為缺損區(qū)植入個(gè)性化的人工甲狀軟骨復(fù)合支架。術(shù)后定期性地分別對兩組動(dòng)物進(jìn)行觀察。記錄動(dòng)物飲食、出聲及術(shù)口等現(xiàn)象。并隨機(jī)分別抽取出A、B組動(dòng)物甲狀軟骨及其周邊組織制成標(biāo)本，醫(yī)學(xué)電鏡下觀測A組軟骨缺損區(qū)的骨組織生長情況及B組植入骨架與動(dòng)物骨組織的結(jié)合情況及新生骨的生長狀況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 泡沫陶瓷起泡反應(yīng)分析 泡沫陶瓷，顧名思義其主要特征就是具備了具有高溫特性的多孔特性。為了實(shí)現(xiàn)泡沫陶瓷的多孔特性，本研究采用了起泡反應(yīng)的方法。而此法的關(guān)鍵就在于起泡劑的選取及其分量的控制。各種表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)都可看做是由親油基和親水基兩部分組成，但其親水親油程度有所差異，即HLB值不同。依據(jù)所需性質(zhì)和應(yīng)用場合的不同，需要挑選具有合適親水親油結(jié)構(gòu)及相對密度的表面活性劑。控制其配比，從而達(dá)到控制親水親油平衡的目的［8］。本例中選擇非離子型表面活性劑TritionX－114，利用其分子對兩相不同的親和力，達(dá)到兩相表面融合于TritionX－114分子內(nèi)部的效果，從而降低兩相界面張力，穩(wěn)定氣泡。

這里采用滴體積法對調(diào)試好的HA漿料進(jìn)行表面張力測試實(shí)驗(yàn)［9］。

圖1 純水校驗(yàn)及漿料的表面張力測試結(jié)果

圖1HA漿料配比為，H2O:5 ml、TritionX－114:0.5 ml、HA:3.16 g。由圖1可以形象地看出添加了表面活性劑TritionX－114的漿料其表面張力明顯降低，當(dāng)然HA也對表面張力值存在一定程度的影響，這里不深入討論。只是想通過圖表更清晰地表達(dá)TritionX－114達(dá)到了預(yù)期想要的效果。

至于起泡劑量的控制，過少的起泡劑使得漿料的起泡效果不佳，過多的起泡劑又會(huì)致使?jié){料形成膠團(tuán)孔隙不均。所以應(yīng)盡量控制比例使?jié){料接近臨界膠束濃度，此時(shí)漿料的表面張力接近最低值［10］。在上述實(shí)驗(yàn)的配比中，雖未能證明該比例的起泡劑的量為最佳值，但是通過對孔隙形狀尺寸大小的觀測以及孔隙率的理論計(jì)算，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果需求即可。

2.2 HA泡沫陶瓷孔隙觀測和力學(xué)強(qiáng)度的分析 圖2中可以清晰地看到制備的泡沫陶瓷孔隙為不規(guī)整的三維立體網(wǎng)絡(luò)開孔結(jié)構(gòu)，孔隙尺寸從100～600 μm不等，集中于150 ～300 μm 范圍內(nèi)。

圖2 HA泡沫陶瓷的孔隙尺寸形貌

由于羥基磷灰石具有較低的力學(xué)性使其使用范圍受限［11］，尤其在人工骨方面，由于人體的生物排異性，輕易在羥基磷灰石中加入增強(qiáng)相以提高其力學(xué)強(qiáng)度，可能會(huì)給生物體帶來不可忽視的副作用。而本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)采取的起泡法是建立在凝膠注模的基礎(chǔ)上。只是通過單體和交聯(lián)劑的凝膠反應(yīng)，從而建立了三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，由此增強(qiáng)了HA陶瓷的力學(xué)強(qiáng)度。通過強(qiáng)度測試顯示，在如此相對較低固相的情況下，HA陶瓷支架的生物力學(xué)強(qiáng)度可達(dá)2.3 mPa。

2.3 HA泡沫陶瓷甲狀軟骨支架孔隙率的測定 通過多組HA陶瓷甲狀軟骨支架進(jìn)行孔隙率實(shí)驗(yàn)測定，結(jié)果表明，參照上述的實(shí)驗(yàn)流程，適當(dāng)調(diào)節(jié)配比，定量純水質(zhì)量60 g，取質(zhì)量比純水:AM∶MABM∶APS=18∶15∶1，反應(yīng)劑 1.2 g，催化劑TEMED約1.8 ml體積，制得若干固相含量為25%的陶瓷軟骨支架其孔隙率最高可達(dá)81.34%，平均孔隙率近似為74.37%。

圖3 多孔HA陶瓷的孔隙率

圖3展示了由排液法測定而得的若干數(shù)組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算最后所得的孔隙率。其最高值為81.34%，最低值為67.11%，平均孔隙率近似為74.37%。

2.4 HA陶瓷甲狀軟骨支架在動(dòng)物體內(nèi)的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果

術(shù)后對動(dòng)物的定期觀察中，比較兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組。B組動(dòng)物在飲食和發(fā)聲方面明顯優(yōu)于A組動(dòng)物。A組標(biāo)本顯微鏡下顯示其軟骨缺陷處出現(xiàn)組織塌陷現(xiàn)象，導(dǎo)致A組動(dòng)物發(fā)聲困難，且飲食量明顯減少。在生物學(xué)顯微鏡下觀測B組軟骨支架區(qū)域標(biāo)本，追蹤發(fā)現(xiàn)，鏡下可見明顯的材料填充區(qū)域，填充材料周圍可見纖維增生伴玻璃樣變，附近有新生軟骨區(qū)域，部分切片可見吞噬材料后的多核細(xì)胞。后期標(biāo)本顯示在填充材料區(qū)域內(nèi)可見明顯的纖維細(xì)胞。新生的軟骨依托HA陶瓷復(fù)合骨架生長，并與陶瓷復(fù)合材料融合，陶瓷材料復(fù)合骨架內(nèi)出現(xiàn)成熟的纖維細(xì)胞。

3 結(jié)論

曲通TritionX－114能夠有效地穩(wěn)定漿料氣泡，由此可通過機(jī)械攪拌法最后制備出平均孔隙率高達(dá)74.37%的HA泡沫陶瓷坯體。

由機(jī)械攪拌法而制備出的泡沫陶瓷其孔隙尺寸無法精確控制，其氣泡孔隙的影響因素還有待進(jìn)一步探討。經(jīng)測定，本次實(shí)驗(yàn)所用的800W攪拌器氣泡所得孔隙大小聚集在150～300 μm之間，能滿足骨架提供組織液循環(huán)的孔隙需求。

控制合適的漿料配比是制備HA泡沫陶瓷甲狀腺軟骨支架的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。必須確保泡沫漿料在氣泡發(fā)生破裂之前及充模完全之后完成凝膠固化的反應(yīng)，從而才能得到需要的孔隙效果和甲狀軟骨支架模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本研究的泡沫漿料配比妥當(dāng)。

所制備得到的HA陶瓷甲狀軟骨支架的生物力學(xué)強(qiáng)度為(2.3±0.2)mPa，可以滿足甲狀軟骨缺損移植要求的強(qiáng)度承受能力。

由人工復(fù)合骨架植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組可以看到明顯的新生骨的生長并試圖吞噬陶瓷材料。在新生骨與陶瓷材料的吞噬和取代的交互過程中，骨架內(nèi)生成了成熟的纖維細(xì)胞，動(dòng)物的軟骨缺損逐步得到修復(fù)。動(dòng)物能正常飲食和發(fā)聲，進(jìn)一步見證了HA陶瓷復(fù)合甲狀軟骨支架在動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用可行性，為其在人體上的應(yīng)用提供借鑒。

［1］王洪嬌，單曉剛.喉環(huán)上切除頸闊肌皮瓣喉重建術(shù)［J］.航空航天醫(yī)藥，2003，14(3):138 －139.

［2］高 輝，張光磊，任書霞.HA生物陶瓷的研究現(xiàn)狀及其在醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用［J］.北京生物醫(yī)學(xué)工程，2007，26(6):655 －658.

［3］田家明，張 波，李 蘇，等.納米羥基磷灰石在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究［J］.遼寧化工，2009，38(11):828 －833.

［4］王朝元，段友容，Boban Markovic，等.羥基磷灰石陶瓷誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，40(6):1110 －1113.

［5］李 丹，孔 迅，李葚煦，等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白與關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(28):5525 －5529.

［6］VAZL，MALMEDAABL.Porositycontrolof hydroxyapatite implant［J］.Mater SciMater In Medicine，1999(10):239 －242.

［7］薛 軍，張永紅.醫(yī)用PLGA(聚乳酸/羥基乙酸)/脫細(xì)胞軟骨支架的研制與性能分析［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47(16):30－32.

［8］BERNARD P.BINKS.Particles as surfactants－ similarities and Differences［J］.Current Opinion in Colloid ＆ Interface Science，2002，(7):21－41.

［9］朱珍瑤，趙國璽.液體表(界)面張力的測定—滴體積法介紹［J］.化學(xué)通報(bào)，1980.

［10］趙 喆，王齊放.表面活性劑臨界膠束濃度測定方法的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用藥物與臨床，2010，13(2):140－144.

［11］MIAO X，LIM W K，HUANG X，et al.Preparation and characterization of interpenetrating phased TCP/HA/PLGA composites Mater Lett，2005，59(29/30):4000 －4005.