劉國(guó)成 袁曉蘭 趙莉娜 袁嘉瑩

普遍認(rèn)為早發(fā)型重度子癇前期母親患病率是晚發(fā)型的2倍，圍產(chǎn)兒患病率是晚發(fā)型的4倍。其特點(diǎn)是發(fā)病早、病情重，常伴有嚴(yán)重的母體并發(fā)癥，導(dǎo)致嚴(yán)重不良妊娠結(jié)局。研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型重度子癇前期存在胎盤(pán)形態(tài)學(xué)異常，而晚發(fā)型胎盤(pán)形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化，認(rèn)為早發(fā)型重度子癇前期為胎盤(pán)病［1］。其真正病因和發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，脂質(zhì)氧化和過(guò)氧化代謝異常是目前探究的熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用RT－PCR及免疫組化方法檢測(cè)胎盤(pán)組織中Nox1、P38MAPK、ROSmPNA表達(dá)水平，旨在探討脂質(zhì)代謝在早發(fā)型重度子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇我院2010年9月～2012年10月住院分娩的患者。研究組中早發(fā)型﹤32周重度子癇前期32例，孕周27～32周，平均孕周(30.7±0.2)周，晚發(fā)型重度子癇前期患者30例，孕周33～37周，平均孕周(35.6±0.4)周;隨機(jī)選擇同期分娩的正常孕婦35例作為對(duì)照組，平均年齡(27.9±8.2)歲，平均孕周(38.7±0.6)周，重度子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《婦產(chǎn)科學(xué)》(7版)［2］。研究組及對(duì)照組年齡及孕齡無(wú)顯著差異(p＞0.05)，研究組均以剖宮產(chǎn)分娩，均無(wú)原發(fā)性高血壓、心臟病、糖尿病及肝腎并發(fā)癥，無(wú)其他妊娠合并癥。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本制備 胎盤(pán)娩出后，無(wú)菌剪取胎盤(pán)臍帶根部附著區(qū)母體面中央1.0 cm×1.0 cm×0.6 cm大小無(wú)鈣化、無(wú)出血壞死的胎盤(pán)組織兩塊，一份用無(wú)菌生理鹽水(含0.1%DEPC水)漂洗，去除血液，置于經(jīng)DEPC水處理并消毒的凍存管中，于－80℃冰箱保存待行RT－PCR檢測(cè);另一份取材后即以4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，浸蠟，包埋，4um切片(每例5張)，載玻片經(jīng)清潔處理，APES包被待測(cè)。

1.2.2 HE染色 ①切片經(jīng)二甲苯脫蠟，8 min×2次，酒精梯度為100%、95%、80%、75% 脫蠟各4 min，0.01 mol/L PBS漂洗6 min×3次;②伊紅染色5 min，蒸餾水沖洗5 min;③蘇木素復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗3 min;④1%鹽酸酒精分化30 s;⑤酒精梯度75%、80%、95%、100%脫水各4 min，二甲苯透明8 min×2次，晾干，中性樹(shù)膠封片。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 鏈霉素親和生物素－過(guò)氧化物酶法(SP法)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。SP試劑盒購(gòu)置XX生物工程有限公司。

1.2.4 結(jié)果分析 以PBS為陰性對(duì)照，細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，無(wú)著色或與背景一致為陰性;采用自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)高倍鏡視野，分別計(jì)算掃描面積及平均光密度，平均光密度值代表陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.5 RT－PCR 引物購(gòu)置上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。從Genebank中獲取Nox1、P38MAPK、ROS的基因序列，設(shè)計(jì)引為為:上游 5'－CCAGTGTGTGAGGGGAGCA－3';下游5'－TCCAGAGATGAGTGGCTTTTGA －3';上游5'－GCCAGAAGGTCCCAAACAAC－3';下游5'－CAGCCAGCAGATAGCAAATGTC－3';內(nèi)參GAPDH的引物為:上游 5'－GAAGGTGAAGGTCGGAGT－3';下游 5'－GAAGATGGTGATGGGATTTC－3'。步驟為①總 RNA提取，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，②總RNA測(cè)定 取2 μl RNA加入198 μl DEPC水中稀釋混勻，分別置于紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)260 nm和280 nm處測(cè)量OD260/OD280比值及OD260值?？瞻讓?duì)照為200 μl DEPC的水。RNA濃度=OD260×40×100/1 000=OD 260×4(μg/ml)。依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。循環(huán)反應(yīng)為:95℃預(yù)變性5 min，反應(yīng)條件為:95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán) 35次，72℃充分延伸7 min。以目的基因PCR擴(kuò)增片段灰度與相應(yīng)內(nèi)參擴(kuò)增片段灰度的比值作為其mRNA表達(dá)水平的參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較用方差分析，指標(biāo)間相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦胎盤(pán)組織Nox1、P38MAPK、ROS表達(dá)水平

見(jiàn)圖 1。由圖 1可以看見(jiàn)重度子癇前期 Nox1、P38MAPK、ROS陽(yáng)性表達(dá)。免疫化學(xué)檢測(cè):A為重度子癇前期組Nox1陽(yáng)性染色，B為正常組Nox1、P38MAPK、ROS染色，C為重度子癇前期組P38MAPK陽(yáng)性染色，D為重度子癇前期ROS陽(yáng)性染色。(均為×400視野)。

圖1 孕婦胎盤(pán)組織Nox1、P38MAPK、ROS表達(dá)水平

2.2 孕婦胎盤(pán)組織Nox1、P38MAPK表達(dá)水平

見(jiàn)表1。由表1可以看出，早發(fā)型及晚發(fā)型患者胎盤(pán)組織中Nox1、P38MAPK表達(dá)水平均明顯高于正常孕組，而且早發(fā)型重度子癇前期組Nox1、P38MAPK表達(dá)水平顯著高于晚發(fā)型重度子癇前期組，p＜0.05。

2.3 孕婦胎盤(pán)組織Nox1、ROS表達(dá)水平

見(jiàn)表2。由表2可以看出，早發(fā)型及晚發(fā)型患者胎盤(pán)組織中Nox1、ROS表達(dá)水平均明顯高于正常孕組，而且早發(fā)型重度子癇前期組Nox1、ROS表達(dá)水平顯著高于晚發(fā)型重度子癇前期組，p＜0.05。

表1 各組孕婦胎盤(pán)組織中Nox1、P38MAPK水平比較

表2 各組孕婦胎盤(pán)組織中Nox1、ROS水平比較

3 討論

子癇前期是妊娠期特發(fā)的全身性疾病，迄今為止仍是我國(guó)孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一。目前認(rèn)為，脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是其發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但其機(jī)制目前仍未完全闡明。p38 MAPK作為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員之一，在胎盤(pán)組織中有廣泛表達(dá)，未活化時(shí)位于細(xì)胞質(zhì)中，其絲氨酸/蘇氨酸殘基可被磷酸化而激活并迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，作用于相應(yīng)靶點(diǎn)。研究證實(shí)在子癇前期發(fā)生過(guò)程中，有些氧化應(yīng)激產(chǎn)物可以激活p38MAPK的磷酸化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及全身炎癥反應(yīng)［3］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)子癇前期合并溶血、肝酶升高、血小板降低(HELLP)綜合征患者的胎盤(pán)組織存在明顯的p38MAPK的活化［4］。本資料顯示，研究組胎盤(pán)組織中滋養(yǎng)細(xì)胞增生細(xì)胞、合體結(jié)節(jié)細(xì)胞、纖維素樣壞死細(xì)胞均明顯高于正常孕者，而且早發(fā)型重度子癇前期組顯著高于晚發(fā)型重度子癇前期組;研究組胎盤(pán)組織中Nox1、P38MAPK表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。提示，P38MAPK在早發(fā)型重度子癇前期發(fā)病中起著重要作用，推測(cè)P38MAPK在早發(fā)型重度子癇前期脂質(zhì)代謝異常及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷途徑中扮演關(guān)鍵角色。

目前研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶家族包括Nox1、Nox2、Nox3、Nox4 和 Nox5 和二元氧化酶(dualoxidase，Duox)。Nox1主要分布在人類的結(jié)腸、前列腺、子宮、胎盤(pán)、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等組織和細(xì)胞中［5］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nox1參與血管生長(zhǎng)、重塑，在高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等血管性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，并且此作用受P38MAPK因子調(diào)節(jié)［6］。本資料顯示Nox1蛋白主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，且早發(fā)型重度子癇前期患者Nox1及ROS表達(dá)水平顯著高于晚發(fā)型組，而且二者具有正相關(guān)性?；钚匝醮刈鳛檠趸瘧?yīng)激的中心環(huán)節(jié)，類似于第二信使的信號(hào)分子，激活許多氧化還原敏感性信號(hào)通路，ROS是調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)的重要信號(hào)分子，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和動(dòng)脈外膜細(xì)胞等均可產(chǎn)生ROS，ROS過(guò)多與炎性反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［7］。有研究認(rèn)為妊娠早期ROS表達(dá)異常，可導(dǎo)致胎盤(pán)病理改變，與子癇前期發(fā)展相關(guān)。本研究證實(shí)早發(fā)型重度子癇前期組胎盤(pán)組織中ROS表達(dá)顯著高于晚發(fā)型組及對(duì)照組，ROS表達(dá)增加與Nox1表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明由P38MAPK介導(dǎo)的P38MAPK－Nox1－ROS途徑可能在早發(fā)型重度子癇前期的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。也提示Nox1在早發(fā)型重度子癇前期脂質(zhì)代謝中起重要作用，可能是早發(fā)型重度子癇前期發(fā)病的預(yù)測(cè)指標(biāo)，有待于進(jìn)一步研究。

近年研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型重度子癇前期與晚發(fā)型重度子癇前期不僅是發(fā)病時(shí)間上存在差異，在發(fā)病機(jī)制、臨床靶器官損害、臨床治療及預(yù)后等方面都有明顯不同［8］。人體蛻膜組織是母胎界面重要組成部分，與胎兒滋養(yǎng)層直接接觸，有參與母胎免疫耐受形成及維持妊娠的功能。本組資料證實(shí)，早發(fā)型重度子癇前期組胎盤(pán)組織中 Nox1、ROS、P38MAPK均呈高表達(dá)狀態(tài)，而且有些發(fā)生在臨床癥狀出現(xiàn)前，進(jìn)一步說(shuō)明早發(fā)型重度子癇前期的發(fā)生與發(fā)展與脂質(zhì)代謝異常密不可分。

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