潘小平 洪曉綠

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球每年約有120萬(wàn)婦女罹患乳腺癌，其中約50萬(wàn)婦女死于該疾病，其發(fā)病率還以每年2%的速度遞增［1］。在我國(guó)占全身惡性腫瘤的7% ～10%，僅次于宮頸癌［2］。HER－2基因位于17號(hào)染色體，編碼生長(zhǎng)因子受體，在20% ～30%的乳腺癌中高度表達(dá)［3］，并且該基因的表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切［4］，因此，檢測(cè)HER－2表達(dá)的情況不僅有助于評(píng)估患者預(yù)后，也有助于治療方案的選擇。目前，HER－2的檢測(cè)常采用免疫組織化學(xué)(IHC)法，但該方法只能檢測(cè)蛋白的含量，且影響因素較多，尤其是早期的乳腺癌中該蛋白含量較低，檢出率也較低。本研究采用不同的熒光素標(biāo)記17號(hào)染色體的著絲粒和HER－2基因，建立全細(xì)胞熒光原位雜交(FISH)法，從分子基因水平檢測(cè)HER－2基因的表達(dá)，并評(píng)價(jià)該方法的臨床使用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取2009年4月1日～2013年5月20日在我院接受乳腺手術(shù)且經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為乳腺癌患者的乳腺組織160例，所有患者均被告知參與本項(xiàng)研究且得到患者同意。乳腺癌的分類(lèi)參照WHO2003標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)本的來(lái)源及構(gòu)成見(jiàn)表1，乳腺癌分期采用TNM分期(T:腫瘤大小，T0:原位癌;T1:腫瘤長(zhǎng)徑≤2 cm;T2:2 cm＜癌瘤長(zhǎng)徑≤5 cm;T3:＞5 cm;T4:不論腫瘤大小直接侵犯胸壁;N0:無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;N1～3:有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;Nx:區(qū)域淋巴結(jié)無(wú)法評(píng)估;G1:高分化;G2:中度分化;G3:低分化;Gx:不能判斷分化程度。)

表1 標(biāo)本的來(lái)源及分類(lèi)

1.2 試劑及儀器

熒光原位雜交成像分析系統(tǒng)，雜交儀，熒光探針，緩沖液(2×SSC，pH 7.0±0.2)，變性液(70%(v/v)甲酰胺/2×SSC，pH7.0～8.0)，乙醇，固定液(甲醇:冰乙酸體積比3∶1)，胃蛋白酶K工作液(0.08 mg/ml)等。

1.3 試驗(yàn)方法

參照J(rèn)ansen［5］等研究的方法在本實(shí)驗(yàn)室條件下作如下改良:將4 μm厚的福爾馬林固定石蠟包埋切片根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)處理程序進(jìn)行處理［6］，切片經(jīng)二甲苯脫蠟后依次浸入100%、80%、70%酒精各10 min脫水，50℃下用30%［W/V］酸性亞硫酸鈉(sodium bisulfite)處理組織切片20～30 min，2×SSC溶液中漂洗5 min，將組織切片浸泡在蛋白酶K工作液(0.2 mg/ml)中，37℃孵育20～30 min，將玻片置于73～78℃的變性液中浸泡5 min后依次置于70%、80%和100%乙醇中梯度脫水，置于45～50℃烤片機(jī)上預(yù)熱3～5 min后與探針雜交，將10 μl探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片封片，置于濕盒中。42℃保溫箱雜交過(guò)夜后，滴加15 μl DAPI復(fù)染劑，暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。

1.4 結(jié)果判斷

首先在HE染色切片上確認(rèn)癌細(xì)胞區(qū)域，然后在10×物鏡下，F(xiàn)ISH標(biāo)本上找到與HE染色切片上相同的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，仔細(xì)觀(guān)察信號(hào);在40×物鏡下掃描整張切片，觀(guān)察是否存在HER－2表達(dá)的異質(zhì)性，以及標(biāo)本的質(zhì)量，滿(mǎn)意的標(biāo)本應(yīng)是75%以上癌細(xì)胞核中都有雜交信號(hào)，在100×物鏡下觀(guān)察癌細(xì)胞核的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)和比值計(jì)算。隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值(Ratio值=30個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/30個(gè)細(xì)胞核中綠信號(hào)總數(shù))。當(dāng)Ratio值＜1.8，顯示無(wú)HER－2基因擴(kuò)增;為陰性標(biāo)本，當(dāng)Ratio值＞2.2，顯示HER－2基因擴(kuò)增;為陽(yáng)性標(biāo)本，當(dāng)Ratio值介于1.8～2.2之間時(shí)，可增加計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞或重新做FISH實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷最終結(jié)果。單個(gè)細(xì)胞17號(hào)染色體著絲粒探針綠色信號(hào)大于2，即為17號(hào)染色體多體。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

直接統(tǒng)計(jì)FISH陰陽(yáng)性個(gè)數(shù)，F(xiàn)ISH陽(yáng)性檢出率各組間的差異采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)n＜40時(shí)，采用Fisher精確概率法，p＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)及其結(jié)果均在SPSS for windows 13.0上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)建立結(jié)果

本研究較為成功地建立了熒光原位雜交法，且陰陽(yáng)性結(jié)果均能達(dá)到試劑盒要求，即在熒光顯微鏡下均能見(jiàn)到各自特異性熒光顏色。圖1為乳腺癌陰性結(jié)果，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)兩個(gè)17號(hào)染色體探針信號(hào)(綠色)以及兩個(gè)HER－2基因探針信號(hào)(紅色);圖2為FISH檢測(cè)乳腺異常結(jié)果，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞，其中紅色信號(hào)200個(gè)，綠色信號(hào)80個(gè)，Ratio值為2.5，即顯示HER－2基因擴(kuò)增;判斷為陽(yáng)性標(biāo)本。且在同一個(gè)細(xì)胞中有三個(gè)綠色信號(hào)(黃色箭頭所示)，即該標(biāo)本還有17號(hào)染色體多體存在。

2.2 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果

用建立好的FISH法檢測(cè)了160例乳腺癌石蠟標(biāo)本，檢出結(jié)果見(jiàn)表2，從表中可以看出，F(xiàn)ISH總的陽(yáng)性檢出率為38.8%(62/160)，隨著腫瘤增大，F(xiàn)ISH陽(yáng)性檢出率越高，伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，陽(yáng)性檢出率也越高，病理級(jí)別越高，其陽(yáng)性檢出率也越高，但陽(yáng)性檢出率在上述三組間并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3，但在組織類(lèi)型組別，F(xiàn)ISH陽(yáng)性檢出率存在顯著性差異(χ2=14.6，＜0.01)，見(jiàn)表3。

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其檢測(cè)方法各式各樣，如高頻超聲、彩色多普勒顯像［7］，以及血氧功能檢測(cè)［8］等，但這些檢測(cè)方法的敏感性和特異性偏低，不能給臨床診斷與治療提供準(zhǔn)確的依據(jù)。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，基因的改變?cè)缬谛螒B(tài)的變化，因此，分子診斷技術(shù)在乳腺癌的診斷與治療過(guò)程中顯得尤為突出。HER－2基因與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切［4］，因此，準(zhǔn)確檢測(cè)HER－2的表達(dá)情況對(duì)于乳腺癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)后有著重要意義［9］，也可指導(dǎo)是否采用赫賽汀單抗進(jìn)行治療［10］。目前，HER－2基因的檢測(cè)主要包括PCR和IHC，PCR法檢測(cè)時(shí)污染嚴(yán)重，假陽(yáng)性率高，IHC法，因其操作簡(jiǎn)單價(jià)格廉價(jià)已廣為病理科應(yīng)用，但該檢測(cè)方法影響因素較多，如在標(biāo)本固定和處理過(guò)程中容易破壞HER－2蛋白，實(shí)用抗體的批號(hào)之間存在差異等，這些均使得IHC結(jié)果準(zhǔn)確率降低。而FISH法是一種基于細(xì)胞遺傳學(xué)的檢測(cè)技術(shù)，利用熒光素標(biāo)記的探針對(duì)HER－2基因和17號(hào)染色體，直接和乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行雜交，穩(wěn)定性好，大大增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性［11］。

表2 FISH陽(yáng)性檢出率

表3 各變量之間的比較

在160例乳腺組織中，F(xiàn)ISH總體的陽(yáng)性檢出率為38.8%(140/160)，與有關(guān)報(bào)道的陽(yáng)性檢出率相差不大［12］。腫瘤越大，陽(yáng)性檢出率越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量越多，陽(yáng)性檢出率也越高，同樣，病理級(jí)別越高，陽(yáng)性檢出率也越高，但在上述三組間FISH陽(yáng)性檢出率并無(wú)顯著性差異，p值在各組間均＞0.05(比較結(jié)果見(jiàn)表3)，而在組織類(lèi)型組織的比較中，F(xiàn)ISH陽(yáng)性檢出率之間卻存在顯著性差異(χ2=14.6，＜0.01)，說(shuō)明FISH在檢測(cè)HER－2基因擴(kuò)增時(shí)與乳腺腫瘤的瘤體大小、病理級(jí)別以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目并無(wú)相關(guān)，而只與乳腺癌的組織類(lèi)型有關(guān)，說(shuō)明HER－2基因在導(dǎo)管型的癌體中表達(dá)較高。

因此，F(xiàn)ISH法能特異敏感地檢測(cè)出乳腺癌中HER－2基因的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，不影響HER－2蛋白的表達(dá)，檢測(cè)的準(zhǔn)確率高，能有效的指導(dǎo)臨床用藥，及時(shí)對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，且該法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速，宜在臨床科室開(kāi)展。

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