趙亞萍，趙錦慧，古紅梅，張永亮

（周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001）

近年來，隨著飼料工業(yè)的飛速發(fā)展，雖然很多人工合成的飼料添加劑如抗生素、調(diào)味劑、激素、防腐劑、促長素等在飼料中普遍添加，對畜牧業(yè)的發(fā)展起到了很大的促進作用，但其導(dǎo)致的負面效果如藥物殘留、抗藥性及對人體等的毒副作用已經(jīng)引起了國內(nèi)外廣大消費者和科研工作者的關(guān)注和憂慮.在目前的情況下，純天然的中草藥飼料添加劑以其具有安全特點、能預(yù)防動物疾病、改善畜禽產(chǎn)品質(zhì)量、提高畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量而日益受到廣泛關(guān)注，從而促進了中草藥飼料添加劑的應(yīng)用和發(fā)展.關(guān)于三叉苦、白英、刺五加、龍葵、半枝蓮等幾味中草藥，其單方抑菌作用研究有報道［1－10］，但有關(guān)這幾味中草藥的復(fù)方制劑抑菌性能研究鮮有報道.筆者通過測定抑菌率、最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）、抑菌圈大小等指標，對三叉苦等5味中草藥組配的9個復(fù)方制劑的抑菌性能進行研究，旨在為開發(fā)和利用中草藥飼料抗菌添加劑提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材

三叉苦、白英、刺五加、龍葵、半枝蓮，購于周口市同和堂大藥店.

1.1.2 供試菌種

大腸桿菌，由周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院提供.

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基.

1.1.4 實驗器具

實驗儀器：電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、干燥箱、超凈工作臺等.

低值易耗品：試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、燒杯、量筒、濾紙、酒精燈、萬用電爐、毫米刻度尺、砂鍋、脫脂棉等.

1.2 方法

1.2.1 三叉苦等5味中草藥復(fù)方制劑活性成分的提取

方1：稱取三叉苦20g，白英20g，刺五加20 g；方2：稱取三叉苦20g，白英20g，龍葵20g；方3：三叉苦20g，白英20g，半枝蓮20g.3個配方中分別加入400mL的蒸餾水，文火加熱煮沸1h，用紗布過濾后得提取液，濾渣用4倍水量煎煮2次后棄去，將3次所得濾液混合并濃縮到60mL 使提取液原液濃度達到1g／mL.方4：稱取三叉苦20 g，白英20g，刺五加20g，龍葵20g；方5：稱取三叉苦20g，白英20g，刺五加20g，半枝蓮20g；方6：稱取三叉苦20g，白英20g，半枝蓮20g，龍葵20g.同法制備，使提取液原液濃度達到1g／mL.方7：稱取三叉苦15g，白英15g，刺五加15g，龍葵15g，半枝蓮15g；方8：稱取三叉苦20g，白英10g，刺五加10g，龍葵15g，半枝蓮20g；方9：稱取三叉苦15g，白英20g，刺五加10g，龍葵20g，半枝蓮10g.同法制備，使提取液原液濃度達到1 g／mL.

將上述各個配方所得提取液在121.3℃下高壓蒸汽滅菌20min后，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 普通培養(yǎng)基及藥液培養(yǎng)基的制備

普通培養(yǎng)基的制備［11］：制備牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基.

藥液培養(yǎng)基的制備［12］：將滅菌的提取液原液用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進行倍比稀釋，分別得到含提取液為0.5g／mL，0.25g／mL，0.125g／mL的藥液培養(yǎng)基.

1.2.3 菌種活化、菌懸液的制備及篩選［13，14］

用無菌接種環(huán)分別從試管斜面上挑取大腸桿菌少許接種于斜面上，37℃活化培養(yǎng)24h.分別挑取活化后的大腸桿菌單個菌落放入無菌生理鹽水中制備成菌液，采用菌懸液OD值測定及平板菌落計數(shù)法調(diào)節(jié)菌液稀釋度，使菌體密度為102cfu／mL.

1.2.4 抑菌率的測定

采用平板菌落計數(shù)法［14］統(tǒng)計9個復(fù)方中草藥提取液不同濃度下的抑菌率，設(shè)對照，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，抑菌率取3個重復(fù)的平均值.

1.2.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定［15，16］

在裝有1mL藥液培養(yǎng)基的各試管中加入0.1 mL的菌懸液（菌懸液的菌體密度為102cfu／mL），37℃恒溫條件下振蕩培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果.以試管中無渾濁現(xiàn)象出現(xiàn)的最低藥液濃度作為MIC，每個濃度下均設(shè)置3個重復(fù)，實驗設(shè)置對照管.

1.2.6 最小殺菌濃度（MBC）的測定［17］

以MIC測定結(jié)果為基礎(chǔ)，從未見細菌生長的各管培養(yǎng)物中吸取0.1mL涂布平板，37℃條件下培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，菌落數(shù)少于5個的最小稀釋度即是最小殺菌濃度.

1.2.7 抑菌圈大小測定

采用藥敏紙片法［18，19］測定各個復(fù)方中草藥提取液的抑菌圈直徑.將濾紙用打孔器制成6mm的小圓紙片，高壓滅菌后放入1g／mL的各個復(fù)方中草藥提取液中，浸泡1～2h，制成藥敏紙片，干燥后備用，對照用無菌水浸泡.吸取0.1mL的菌懸液于平板中央，用玻璃涂棒將菌液均勻涂布于平板上.含菌平板倒置干燥約30min后，用無菌鑷子取藥敏紙片均勻貼在平板上，每個平板貼3個藥敏紙片，每個處理做3個平板.20min后，將平板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24h.用毫米刻度尺測量抑菌圈直徑，以3個平板的平均值表示抑菌圈直徑.

藥敏紙片法可參考以下標準記錄結(jié)果：抑菌圈為16～20mm，表示高度敏感；11～16mm，表示中度敏感；10～11mm表示輕度敏感；小于10mm，表示不敏感.

2 結(jié)果與分析

2.1 5味中草藥組配的9個復(fù)方制劑對大腸桿菌的抑菌率

9個復(fù)方制劑在不同濃度下對大腸桿菌的抑菌率統(tǒng)計結(jié)果見表1.由表1可知：各個濃度下，9個復(fù)方制劑對大腸桿菌均有不同程度的抑制作用，且抑菌效果隨著復(fù)方制劑濃度的增大而增強.當(dāng)濃度為0.5g／mL時，9個復(fù)方制劑對大腸桿菌的體外抑菌作用強度為方9＞方5＞方3＞方7＞方6＞方8＞方1＞方4＞方2；當(dāng)濃度為0.25g／mL和0.125g／mL時，9個復(fù)方制劑的抑菌作用強度均為方5＞方9＞方3＞方7＞方6＞方8＞方4＞方1＞方2.此結(jié)果顯示，復(fù)方制劑的抑菌效果強弱和其包含的中草藥種類多少并非呈正相關(guān)，并不是配伍的中草藥種類越多，抑菌效果就越強.此外，方1、方2、方3均包含3味藥材，其中2味相同，1味不同；方4、方5均包含4味藥材，其中3味相同，1味不同；方4、方6均包含4味藥材，其中3味相同，1味不同；方5、方6均包含4味藥材，其中3味相同，1味不同.其抑菌率顯示明顯的差異，這表明復(fù)方制劑的抑菌效果和配伍的中草藥種類有密切關(guān)系.最后，方7、方8、方9均由相同的5味中草藥配伍而成，僅各中草藥的用量有差異，但其抑菌率也差異明顯，這說明復(fù)方制劑的抑菌效果和各中草藥之間的用量配比關(guān)系密切.

2.2 5味中草藥組配的9個復(fù)方制劑對大腸桿菌的抑菌圈大小

9個復(fù)方制劑在1g／mL濃度下對大腸桿菌的抑菌圈大小統(tǒng)計結(jié)果見表2.由表2可知：9個復(fù)方制劑對大腸桿菌的抑菌圈大小存在差異，大腸桿菌對方9表現(xiàn)出高度敏感，對方3、方5、方6、方7表現(xiàn)出中度敏感，對方1、方4、方8表現(xiàn)出輕度敏感，對方2表現(xiàn)出不敏感.從抑菌圈大小測定結(jié)果看，9個復(fù)方制劑在1g／mL濃度下的抑菌強度為方9＞方5＞方3＞方6＞方7＞方8＞方4＞方1＞方2.這與上述抑菌率統(tǒng)計結(jié)果不一致，說明復(fù)方制劑的濃度對抑菌效果影響明顯，每個復(fù)方制劑都有一個抑菌殺菌效果較好的合適濃度.

表1 9個復(fù)方制劑在不同濃度下對大腸桿菌的抑菌率統(tǒng)計結(jié)果

表2 9個復(fù)方制劑對大腸桿菌的抑菌圈大小統(tǒng)計結(jié)果

2.3 9個復(fù)方制劑對大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

不同濃度的復(fù)方制劑下大腸桿菌的生長情況見表3，9個復(fù)方制劑對大腸桿菌的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度統(tǒng)計結(jié)果見表4.由表3可知，方5、方9在0.5g／mL和0.25g／mL的濃度下，試管內(nèi)均無渾濁現(xiàn)象；方3、方6、方7、方8在0.5g／mL的濃度下，試管內(nèi)無渾濁現(xiàn)象，其余各管中均有不同程度的渾濁現(xiàn)象.從表4可以看出，方5的MIC和MBC均為0.25g／mL；方9的 MIC為0.25g／mL，MBC為0.5g／mL；方3、方6、方7、方8的MIC均為0.5g／mL，但其MBC未確定；其余各方的MIC和MBC均未確定.

表3 不同濃度的復(fù)方制劑下大腸桿菌的生長情況

表4 9個復(fù)方制劑對大腸桿菌的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度

3 討論

實驗結(jié)果顯示，不同中草藥組配的復(fù)方制劑對大腸桿菌的抑菌、殺菌效果不同，同一種復(fù)方制劑不同濃度下，大腸桿菌對其敏感性不同.抑菌效果強弱并非由復(fù)方制劑中所含的中草藥種類多少決定，而是由復(fù)方制劑中所含的中草藥種類及各種中草藥之間的用量配比所決定.

研究發(fā)現(xiàn)在抑菌率、抑菌圈大小等指標統(tǒng)計上，不同濃度下9個復(fù)方制劑的抑菌效果強弱排序并不一致，可能因為中草藥復(fù)方制劑作用機制復(fù)雜，多種中草藥自身的化學(xué)成分之間會相互發(fā)生反應(yīng)，而且活性成分提取中條件上存在的稍微差異也會造成最終的有效成分含量有差異，從而影響抑菌效果.

中草藥屬于純天然的物質(zhì)，具備營養(yǎng)與治療2種功效，具有與食物同體、同源、同用的特點，很多中草藥人類和動物是可以食用的，這也是抗生素、現(xiàn)代化學(xué)合成藥物等無法比擬的［20］.對中草藥復(fù)方制劑作為飼料中的防病抗病添加劑或者作為營養(yǎng)添加劑的研究［21］較少，而且目前實際應(yīng)用作為飼料添加劑的中草藥品種并不多，因此有待進一步研究開發(fā).

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