高海寧，馬國(guó)泰，李彩霞，陳勇，宋濤，張勇，4，焦揚(yáng)，4*

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,甘肅 張掖 734000； 2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省鵬宇生態(tài)環(huán)保工程公司,甘肅 蘭州 730000；4.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 張掖 734000)

鉻鹽是重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于電鍍、化工、皮革、耐火材料等行業(yè)。鉻鹽生產(chǎn)及其產(chǎn)品應(yīng)用的各個(gè)環(huán)節(jié)都可能產(chǎn)生含Cr廢水。由于Cr(Ⅵ)具有致癌性、致突變性、對(duì)生物體具有很強(qiáng)的毒性，被列為國(guó)際公認(rèn)的3種致癌金屬物之一[1-2]。我國(guó)是鉻產(chǎn)品生產(chǎn)和使用大國(guó)，因此Cr(Ⅵ)污染治理是一個(gè)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。我國(guó)人口壓力大，耕地資源緊張，安全有效地修復(fù)重金屬污染土壤，既可實(shí)現(xiàn)土地資源的再利用，同時(shí)，又可避免重金屬通過(guò)食物鏈遷移。相對(duì)于Cr(Ⅵ)，Cr(Ⅲ)毒性較低，對(duì)環(huán)境影響較小，因此土壤Cr(Ⅵ)污染的修復(fù)機(jī)制通常有兩種[3-4]：一是改變Cr在土壤中的存在形態(tài)，將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)，降低其在環(huán)境中的遷移能力和生物可利用性；二是將Cr從被污染土壤中清除。

Cr(Ⅵ)污染土壤的微生物修復(fù)是利用土壤中的土著微生物或經(jīng)馴化的特定微生物，通過(guò)將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)，達(dá)到降低Cr的移動(dòng)性和毒性等目的[5]。鉻渣堆場(chǎng)鉻污染土壤中土著微生物對(duì)Cr(Ⅵ)具有很強(qiáng)的還原能力，直接向土壤中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可刺激土著微生物活性，將Cr污染土壤中Cr(Ⅵ)還原成Cr(Ⅲ)進(jìn)行Cr污染土壤的微生物修復(fù)[6]。但從機(jī)理上，微生物不利于收集或富集重金屬，因而，單獨(dú)應(yīng)用微生物修復(fù)金屬污染土壤受到限制[7]。通過(guò)耐Cr植物對(duì)Cr污染場(chǎng)地的綠化與覆蓋，控制Cr向深層土壤移動(dòng)是控制Cr(Ⅵ)污染的重要措施[8]。孟慶恒等[9]篩選出4株對(duì)Cr(Ⅵ)的清除率大于50%的土著菌株，并與玉米(Zeamays)幼苗組合進(jìn)行微生物-植物聯(lián)合修復(fù)，具有明顯降低培養(yǎng)液中Cr(Ⅵ)濃度的效果，因此，研究微生物對(duì)重金屬污染修復(fù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

高羊茅(Festucaarundinacea)和黑麥草(Loldiumperenne)是兩種常見(jiàn)的多年生冷季型草坪草，也是溫帶地區(qū)重要的禾草類牧草。發(fā)現(xiàn)高羊茅和黑麥草具有吸收不同重金屬的能力，楊卓等[10]對(duì)兩種坪草富集Zn、Cd、Pb的能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩種坪草對(duì)Zn污染土壤的修復(fù)能力較強(qiáng)；張蕾等[11]通過(guò)盆栽試驗(yàn)，研究黑麥草對(duì)復(fù)合污染河道浚底泥的修復(fù)效果，結(jié)果表明，黑麥草對(duì)Zn、Cd、Cu的富集能力強(qiáng)，是修復(fù)重金屬-有機(jī)復(fù)合物的良好植物；趙樹蘭和多立安[12]研究Cu2+與Zn2+對(duì)高羊茅生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示高羊茅根系和莖葉具有富集重金屬的能力；Zhu等[13]研究尾礦污染土壤對(duì)高羊茅和早熟禾(Poaannua)生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)這些坪草對(duì)重金屬具有吸耐能力。以上研究主要集中在坪草對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)等方面，或者研究對(duì)象單一，并未涉及菌劑對(duì)鉻(Ⅵ)污染土壤中坪草幼苗生理方面的相關(guān)報(bào)道。

本研究以高羊茅和黑麥草為材料，以Cr(Ⅵ)污染土壤為基質(zhì)，以期檢測(cè)菌劑處理對(duì)Cr(Ⅵ)污染土壤中高羊茅和黑麥草幼苗生理生化特性的影響，擬為Cr污染場(chǎng)地的微生物-植物聯(lián)合治理提供技術(shù)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌劑 從張掖周邊鹽堿化和Cr污染土壤中篩選到革蘭氏陰性芽孢桿菌Rs-2和K1，革蘭氏陽(yáng)性芽孢菌Rs-4。3株菌具有在鹽堿環(huán)境中溶磷、硅的特性[14]，且Rs-2、K1菌株可將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)。將菌株發(fā)酵得到高密度菌液，以Rs-2∶Rs-4∶K1=9∶6∶4比例得到混合菌液，加入1.5%的載體材料和0.1%的甘油，制備得到復(fù)合菌劑，以培養(yǎng)基代替菌液再加入1.5%的載體材料和0.1%的甘油作為對(duì)照。

1.1.2供試土壤與植物 Cr(Ⅵ)污染土壤采自甘肅省張掖市民樂(lè)縣富源化工有限公司污水口周邊。Cr(Ⅵ)污染土壤采回后錘碎，挑除石子，備用。供試植物為高羊茅和黑麥草。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基 菌液發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，MgSO40.2，pH自然。

1.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)于2012年3-7月在河西學(xué)院植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試土壤按80∶10∶1的比例將Cr(Ⅵ)污染土壤∶有機(jī)肥(羊糞與玉米芯堆肥)∶菌劑混合均勻，加適量水后密封，每天攪拌一次，7 d后土壤處理完成。將處理后的Cr(Ⅵ)污染土壤均勻裝入育苗盤中。每穴播種經(jīng)30% H2O2表面殺菌種子20粒，然后覆蓋1 cm左右處理過(guò)的土壤，澆透水至育苗盤底滲出水為止，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)育苗盤(4×9=36孔)，每天進(jìn)行管理，使土壤保持濕潤(rùn)，待兩種坪草出芽后對(duì)植株進(jìn)行間苗，每缽保留10株。當(dāng)植物幼苗生長(zhǎng)至3葉齡時(shí)，對(duì)照組(CK)澆灌稀釋5倍的對(duì)照液，處理組澆灌稀釋5倍的菌劑，在植物幼苗處理6 d后，測(cè)定幼苗生理指標(biāo)，每項(xiàng)指標(biāo)做3組平行。

1.3 分析方法

1.3.1土壤指標(biāo)測(cè)定方法 土壤pH值的測(cè)定采用酸度計(jì)法；可溶性鹽的測(cè)定采用質(zhì)量法；土壤Cr(Ⅵ)含量的測(cè)定采用二苯碳酰二肼比色法[15]。

1.3.2生化指標(biāo)測(cè)定方法 稱取植物葉片0.2 g，加入50 mmol/L pH 7.8的磷酸緩沖液研磨，4℃、10000 r/min離心10 min，上清液定容至5 mL，得粗酶液備用。POD(peroxidase，過(guò)氧化物酶)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；SOD(superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光還原法；CAT(catalase，過(guò)氧化氫酶)活性測(cè)定采用紫外分光光度法；葉綠素含量測(cè)定采用分光光度法；脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮比色法；細(xì)胞膜透性測(cè)定采用電導(dǎo)法；丙二醛(MDA)的測(cè)定采用2-硫代巴比妥酸法；植物組織根部、地上部分Cr含量測(cè)定采用火焰原子吸收分光光度法[16]。

根據(jù)植物根、葉組織Cr的含量計(jì)算生物富集系數(shù)：生物富集系數(shù)=坪草鉻含量(mg/kg DW)/土壤鉻含量(mg/kg)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理做3次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示各指標(biāo)的大小，采用SSR法檢驗(yàn)差異顯著性。Origin Lab 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試土壤處理前后的變化

由表1可見(jiàn)，供試土壤被菌劑處理后，其pH從7.38增長(zhǎng)為8.25，而可溶性鹽和Cr(Ⅵ)分別從6.20%和53.9 mg/kg降為5.25%和23.6 mg/kg，

表1 供試土壤處理前后的指標(biāo)變化

注：采用Duncan’s multiple range test 方法分析，同列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)，下同。Note: Analysis using Duncan’s multiple range test method, the different letters in the same column show significant difference (P<0.05,n=3), the same below.且供試土壤被菌劑處理前后Cr(Ⅵ)的變化差異顯著。

2.2 菌劑對(duì)坪草幼苗根和地上部分Cr含量的影響

由表2可知，污染土壤中Cr被坪草吸收后，大部分停留在根部，少量向地上部分遷移。CK組較處理組葉和根中的Cr含量差異均顯著。CK組坪草葉中Cr含量為根中Cr含量的11%～14%；而處理組葉中Cr含量為根中Cr含量的31%～39%。由生物富集系數(shù)可見(jiàn)，CK組兩種坪草葉Cr的生物富集系數(shù)為0.62和0.50，而處理組的生物富集系數(shù)增大至1.10和1.05，由此，處理前后根中Cr含量在降低，而葉中Cr含量在增加。且兩坪草根和葉對(duì)Cr的富集有差異，其中高羊茅對(duì)Cr富集略高于黑麥草，但差異不顯著。

表2 坪草幼苗根系、地上部分鉻的含量

2.3 菌劑對(duì)坪草幼苗葉綠素含量的影響

圖1 Cr(Ⅵ)污染土壤中坪草幼苗葉綠素含量

從圖1可見(jiàn)，CK組兩坪草幼苗葉綠素的含量是1.44和1.68 mg/g FW，經(jīng)菌劑處理后，高羊茅和黑麥草幼苗總?cè)~綠素含量增加至2.19和1.98 mg/g FW。兩坪草處理組葉綠素含量均高于CK組，而且高羊茅的這種變化差異顯著，可見(jiàn)，在坪草幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中輔以菌劑處理，可使幼苗葉綠素含量增加。

2.4 菌劑處理對(duì)坪草幼苗保護(hù)酶系的影響

由表3可見(jiàn)，菌劑處理后，高羊茅和黑麥草的SOD和CAT都高于CK組，處理組是CK組的1.13，1.47倍和1.19，1.04倍，但處理組較CK組，兩坪草的POD、CAT以及高羊茅的SOD差異均不顯著，而黑麥草的SOD處理前后差異顯著。加菌劑處理后，高羊茅的POD活性較CK組降低，處理組是CK的0.85倍。

2.5 菌劑處理對(duì)坪草幼苗脯氨酸、丙二醛和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由表4可知，處理組較CK組，黑麥草的MDA、脯氨酸和相對(duì)電導(dǎo)率均有一定程度的降低，且差異顯著。高羊茅的處理組較CK組，脯氨酸變化差異顯著，雖MDA和相對(duì)電導(dǎo)率有一定程度降低，但差異不顯著。由此，經(jīng)菌劑處理后兩坪草的脯氨酸含量降低較明顯，黑麥草的MDA和相對(duì)電導(dǎo)率較高羊茅的降低更為顯著。

表3 菌劑對(duì)Cr(Ⅵ)污染土壤坪草幼苗細(xì)胞保護(hù)酶活性的影響

表4 菌劑對(duì)Cr(Ⅵ)污染土壤坪草幼苗脯氨酸、丙二醛和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

3 討論

常文越等[2]在25℃、投加2%的還原菌，在施用菌劑1個(gè)月后，土壤浸出液Cr(Ⅵ)濃度范圍從10～55 mg/L降低至0.75 mg/L以下。在實(shí)驗(yàn)中對(duì)供試土壤采用菌劑處理后，污染土壤中Cr(Ⅵ)的濃度從53.9 mg/kg降為23.6 mg/kg，且土壤pH略升而含鹽量略降，可能是菌劑的還原作用降低了Cr(Ⅵ)在污染土壤中的含量，因此，菌劑對(duì)Cr(Ⅵ)污染土壤具有一定的改良效果。

重金屬元素能否向植物地上部分，特別是向葉片部分的遷移是判斷超積累植物的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[17]。重金屬在植物體內(nèi)的積累有很大的差異，不同植物對(duì)重金屬的策略也不一致，有的采用富集策略，也有的采用排斥策略[18]。Zayed等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在使用Cr(Ⅵ)培養(yǎng)液后，供試作物根中含量為160～350 mg/kg DW，莖中含量為1.6～2.0 mg/kg DW，即重金屬Cr在植物體內(nèi)新陳代謝旺盛的器官中蓄積量較大[9]。實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)供試植物在Cr(Ⅵ)污染土壤中生長(zhǎng)時(shí)，在幼苗期輔以菌劑處理，Cr在高羊茅和黑麥草根中的積累從103.51和102.96 mg/kg降為81.55和62.91 mg/kg，但兩種坪草葉對(duì)Cr的生物富集系數(shù)從0.62和0.50增長(zhǎng)為1.10和1.05。由此可得，菌劑處理對(duì)緩解Cr在新陳代謝旺盛的器官中的蓄積有明顯效果，而且可以提高Cr在坪草地上部分，尤其是葉中的生物富集量。

葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，它受重金屬的影響比較明顯。王愛(ài)云和黃珊珊[19]以外源Cr(Ⅵ)濃度在0～300 mg/kg范圍內(nèi)模擬Cr污染土壤，高羊茅幼苗總?cè)~綠素含量從3.43 mg/g降為2.81 mg/g。本實(shí)驗(yàn)中菌劑處理后，高羊茅幼苗葉中總?cè)~綠素含量從1.44 mg/g FW增加至2.19 mg/g FW，葉綠素總量低于報(bào)道值的3.43 mg/g，可能源于Cr(Ⅵ)污染土壤成分更為復(fù)雜，且有5.25%的鹽含量，但菌劑處理后將幼苗葉綠素總量提高了52.1%。因此，幼苗期輔以菌劑處理可以緩解坪草在Cr(Ⅵ)脅迫條件下幼苗葉綠素的降低程度，但不同坪草提高幅度有差異。

POD、SOD和CAT是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個(gè)重要保護(hù)酶，當(dāng)植物處于逆境條件下，POD、SOD、CAT保護(hù)酶通過(guò)協(xié)調(diào)作用能有效清除OH-，O2-等自由基，防御膜脂過(guò)氧化，使植物細(xì)胞膜免受傷害。SOD和CAT活性的同時(shí)提高十分重要，由于SOD在清除自由基時(shí)，同時(shí)生成H2O2自由基，它可以通過(guò)Fenton型Haber-Weiss反應(yīng)生成更多的自由基，CAT活性提高能與SOD協(xié)同作用更好地保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基的傷害[20]。本研究結(jié)果表明，菌劑處理后，高羊茅和黑麥草的SOD和CAT活性都高于CK組，處理組是CK的1.13，1.47倍和1.19，1.04倍，表明在植物幼苗期輔以菌劑處理，可增加高羊茅和黑麥草的SOD和CAT活性來(lái)清除由Cr而引起的氧化傷害，與高羊茅相比較，黑麥草SOD活性增幅更高。

孫健等[21]報(bào)道重金屬脅迫能誘導(dǎo)植物組織中POD總活性升高，這是對(duì)所有污染脅迫的共同響應(yīng)。POD利用H2O2來(lái)催化對(duì)自身有害過(guò)氧化物的氧化和分解[22]；許長(zhǎng)成等[23]報(bào)道大豆(Glycinemax)在干旱條件下，大豆葉片H2O2含量增加，CAT活性降低，POD活性隨著升高，由此POD活性的變化與干旱條件的H2O2有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在Cr處理下，菌劑對(duì)高羊茅的POD活性的影響有所不同，高羊茅在不加菌劑時(shí)，其葉片中POD活性達(dá)到了485.6 U/g FW，而加菌劑后使高羊茅POD活性下降，但是CAT活性增加，推測(cè)Cr(Ⅵ)污染土壤高羊茅幼苗體內(nèi)CAT活性強(qiáng)于POD，H2O2的積累量減少，從而使POD活性出現(xiàn)下降。而黑麥草加入菌劑后POD、CAT、SOD活性均高于CK組，三者酶協(xié)同作用，降低Cr的氧化損傷，使得MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于對(duì)照組，保護(hù)了膜的完整性，但相比較而言，高羊茅幼苗體內(nèi)MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率降低幅度較小。

脯氨酸在植物滲透調(diào)節(jié)中起著重要的作用。脯氨酸的合成、累積及代謝是一個(gè)受非生物脅迫和細(xì)胞內(nèi)脯氨酸濃度調(diào)控的生理生化過(guò)程[24-25]。脯氨酸含量升高，是植物受到重金屬毒害的一個(gè)重要特征。張小艾等[26]認(rèn)為，對(duì)于脯氨酸含量在逆境下增加是一種傷害反應(yīng)的觀點(diǎn)不一，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中，CK組的Cr(Ⅵ)污染土壤中兩種坪草脯氨酸含量顯著高于菌劑處理組，說(shuō)明在Cr脅迫下脯氨酸含量的升高是維持細(xì)胞滲透勢(shì)，對(duì)植物細(xì)胞具有保護(hù)作用，輔以菌劑后脯氨酸含量降低，而保護(hù)酶活性升高，MDA和細(xì)胞電導(dǎo)率的處理組/CK均小于1，降低了Cr(Ⅵ)污染土壤對(duì)黑麥草和高羊茅幼苗細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的破壞程度和氧化損傷，減緩了Cr(Ⅵ)對(duì)兩種坪草的毒害作用[27]。

4 結(jié)論

在坪草幼苗期輔以菌劑處理，對(duì)緩解Cr在新陳代謝旺盛器官中的蓄積有明顯效果，而且可以提高Cr在坪草地上部分，尤其是葉中的生物富集量；并能夠降低Cr(Ⅵ)污染土壤坪草幼苗的質(zhì)膜透性和MDA含量，提高POD、SOD和CAT保護(hù)酶活性。采用菌劑處理Cr(Ⅵ)污染土壤，可降低Cr(Ⅵ)污染土壤中Cr(Ⅵ)的含量，對(duì)Cr(Ⅵ)污染土壤具有一定的修復(fù)和改良效果。