方金紅

(安科余良卿藥業(yè)公司，安徽安慶 246001)

丹皮酚作為牡丹皮(Moutan Cortex)的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗氧化等作用，近年來受到越來越多的關注［1-3］。丹皮酚可以在植物體中萃取，但是受到資源限制，產(chǎn)量不高。利用化學原料人工合成丹皮酚，價廉易得，操作簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。丹皮酚的人工合成工藝大致包括將間苯二酚乙?；频?，4-二羥基苯乙酮，再經(jīng)甲基化制得2-羥基-4-甲氧基苯乙酮(丹皮酚)兩個步驟。而硫酸二甲酯(DMS)作為一種良好的甲基化試劑，被廣泛運用于丹皮酚的化學合成［4-7］。但DMS劇毒，對局部黏膜有強烈的刺激和腐蝕作用，急性中毒后可能導致染色體突變，產(chǎn)生致畸致癌作用［8-10］。故應有一種準確而靈敏的分析方法來檢測化學合成丹皮酚中的硫酸二甲酯殘留以控制其限量。本方法運用柱前衍生的方法，將硫酸二甲酯與對硝基苯酚在堿性及加熱的條件下發(fā)生反應生成對硝基茴香醚，再通過紫外檢測器對其衍生產(chǎn)物進行檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 島津GC-2010型氣相色譜儀，島津LC-20AD型液相色譜儀，島津RID-10A示差折光檢測器，梅特勒-托利多AL-204型電子天平，毛細管柱(PEG-20M，30 m × 0.53 mm ×1 μm，蘭州中科凱迪化工新技術有限公司)，液相色譜柱(C18，250 mm ×4.6 mm × 5 μm，YMC)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(GC，Tedia，1101545)，二甲基亞砜(DMSO)(GC，阿拉丁，J1330031)，正己烷(HPLC，Tedia，12100708)，異丙醇(HPLC，Tedia，13020422)，甲醇(HPLC，Sigma-aldrich)，硫酸二甲酯(工業(yè)級，山東興輝化工，121214)，對硝基苯酚(AR，國藥集團，20130222)，NaOH(AR，上海蘇懿化學試劑有限公司，20121030)，丙酮(AR，上海中試化工總公司，20120103)，乙醚(AR，上海中試化工總公司，20111206)，對硝基茴香醚(AR，Aladdin Industrial Corporation，E1331040)，化學合成丹皮酚(合肥立方制藥股份有限公司，130510，130517，130522)。

圖1 硫酸二甲酯氣相色譜法檢測圖譜

1.2 氣相色譜法［11］程序升溫:50℃保持3 min，以30℃·min-1升溫至180℃，保持6 min;進樣口溫度:200℃;FID 溫度:250℃;柱流速:6 mL·min-1;分流比:10∶1。分別用 DMF及 DMSO為溶劑，制成每毫升含硫酸二甲酯約50 μg的供試溶液，進樣2 μL，記錄色譜圖，見圖1。

1.3 正相液相色譜法［12］流動相:正己烷—異丙醇=70∶30;流速:1.0 mL·min-1;RID-10A 示差折光檢測器。以流動相為溶劑，制成每毫升含硫酸二甲酯10 μg的供試溶液，進樣20 μL，記錄色譜圖，見圖2。

圖2 硫酸二甲酯正相液相色譜—示差法檢測圖譜

1.4 柱前衍生—高效液相色譜法［13-14］

1.4.1 反應原理 硫酸二甲酯在堿性和加熱的條件下與對硝基苯酚反應生成對硝基茴香醚，經(jīng)C18柱分離，用紫外檢測器檢測(305 nm)。以保留時間定性，峰面積定量。反應方程式如下:

1.4.2 實驗操作 取10 mL丙酮加于100 mL量瓶中，精密稱定，加入數(shù)滴硫酸二甲酯，精密稱定，兩次稱量之差即為硫酸二甲酯的質量。加丙酮稀釋至刻度，計算每毫升溶液中硫酸二甲酯的含量，臨用前配制。取2 mL硫酸二甲酯丙酮溶液，加0.4 g對硝基苯酚，8 mL 0.3%氫氧化鈉溶液，充分混勻。在40℃水浴中恒溫1 h，取出冷至室溫。用10 mL乙醚在分液漏斗中提取3 min，靜置分層。精密量取20 μL乙醚提取液作為對照溶液進樣。取化學合成丹皮酚約3 g，精密稱定，加丙酮溶解，取2 mL，同法操作，制得乙醚提取液作為供試溶液，精密量取20 μL 進樣。

1.4.3 色譜條件 檢測波長:305 nm;柱溫:55℃;流動相:甲醇∶水 =25∶75;流速:1.0 mL·min-1;進樣 20 μL，記錄色譜圖，見圖 3。

圖3 硫酸二甲酯柱前衍生—高效液相色譜法檢測

2 結果

2.1 反應條件對衍生產(chǎn)物轉化率的影響 試驗考察了不同反應時間、不同反應溫度、不同氫氧化鈉的濃度條件下，硫酸二甲酯生成對硝基茴香醚的衍生反應轉化率。在所考察的不同反應時間、反應溫度、加入氫氧化鈉濃度等反應條件范圍內(nèi)，衍生反應的轉化率幾乎沒有變化，較為穩(wěn)定，結果見表1。

2.2 精密度

2.2.1 進樣精密度 在柱前衍生—高效液相色譜法色譜條件下，取上述硫酸二甲酯反應后的乙醚提取液，連續(xù)進樣6針，各硫酸二甲酯衍生產(chǎn)物的峰面積RSD小于2.0%，說明儀器的進樣精密度良好。

2.2.2 日內(nèi)精密度 按1.4.2項下對照溶液制備方法制備硫酸二甲酯溶液7份，1份作為對照，其余6份作為供試，反應后分別測定供試中硫酸二甲酯衍生產(chǎn)物的含量，計算RSD=1.69%(n=6)，結果見表2。

表1 不同反應條件衍生產(chǎn)物的轉化率

2.2.3 日間精密度 按日內(nèi)精密度試驗方法，在不同的時間，由不同的人員，在不同的儀器上測定樣品溶液的峰面積并計算含量(標示量%)，計算兩次試驗的精密度，RSD=1.89%(n=12)，結果見表3。

2.3 定量限與檢測限 本方法測定硫酸二甲酯殘留的最低檢測限為0.82 ng，最低定量限為2.44 ng，定量限濃度樣品6次連續(xù)進樣的結果保留時間的RSD值小于2%，峰面積的RSD值小于10%。

2.4 線性與范圍 在硫酸二甲酯為0.122～1.220 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，濃度C(mg·L-1)與峰面積A呈良好的線性關系，結果見表4。

表2 日內(nèi)精密度試驗結果(n=6)

表3 日間精密度試驗結果(n=12)

表4 線性與范圍試驗結果

2.5 加樣回收率 分別制備加入高、中、低硫酸二甲酯濃度的丹皮酚供試溶液各3份，按外標法以峰面積計算硫酸二甲酯的測得量，測得硫酸二甲酯的平均回收率在80% ～120%范圍內(nèi)，平均回收率為98.8%，RSD=1.4%(n=9)，結果見表5。

表5 加樣回收率試驗結果

2.6 穩(wěn)定性 按硫酸二甲酯對照溶液的制備方法，制備硫酸二甲酯溶液，反應后分別在不同的時間用兩臺液相色譜儀器(一臺進樣器控溫為4℃，另一臺不控溫)檢測硫酸二甲酯衍生產(chǎn)物的峰面積，檢測結果如下:4℃時，在0、2、4、8、12、24 h 時，峰面積分別為 6 753、6 804、6 816、6 934、6 859、6 957，平均峰面積為6 854，RSD為1.15%(n=6);常溫時，在 0、1、2、3、4 h 時，峰面積分別為 6 526、6 633、7 016、7 409、7 537，平均峰面積為 7 024，RSD 為6.42%(n=5)。

2.7 樣品檢測結果 分別取3個批次化學合成丹皮酚樣品，按擬定的方法進行測定，均未檢出硫酸二甲酯的殘留。

3 討論

硫酸二甲酯無紫外吸收，嘗試分別采用GC法、HPLC-RID法進行試驗。試驗表明，硫酸二甲酯遇高溫分解，用直接進樣的GC法檢測時裂分成3～4個峰;HPLC-RID法的靈敏度過低，定量限高達約200 ng，無法滿足限度控制要求。

運用柱前衍生化高效液相色譜法檢測化學合成丹皮酚中的硫酸二甲酯殘留，衍生反應的轉化率較高且穩(wěn)定，耐用性好，丹皮酚樣品不干擾對硫酸二甲酯的檢測，專屬性好，檢測限(0.82 ng)及定量限(2.44 ng)均滿足限度控制要求，靈敏度高，在0.122～1.220 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積的線性關系良好，高、中、低三個濃度平均加樣回收率98.8%，準確度高，方法日內(nèi)、日間精密度均良好。本法適用于化學合成丹皮酚中硫酸二甲酯殘留的檢測。運用本法測定化學合成丹皮酚中硫酸二甲酯殘留時需注意，由于用于檢測的供試溶液為乙醚提取物，乙醚極易揮發(fā)，在常溫時應立即檢測或將供試溶液低溫保存。

［1］ Li H，Wang SW，Zhang BL，et al.Simultaneous quantitative determination of 9 active components in traditional Chinese medicinal preparation ShuangDan oral liquid by RP-HPLC coupled with photodiode array detection［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，56(4):820-824.

［2］ 馬 嘉，李 蔚，陳 瑞.丹皮酚滲透泵片包衣膜處方工藝考察［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(5):754-757.

［3］ 劉雁麗，韋柳成，沈振國，等.丹皮酚的藥理作用、提取及含量測定方法研究進展［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15(7):896-899.

［4］ 汪顯陽，朱貞石，胡瑞芳.正交設計法優(yōu)選丹皮酚的合成工藝［J］.中國藥物化學雜志，1993，3(3):187-189.

［5］ 高 鑫，陳光勇，劉光明.丹皮酚的合成研究［J］.大理學院學報，2008，7(4):3-4.

［6］ 薛 芬，戴華娟，王建中，等.丹皮酚(2-羥基-4-甲氧基苯乙酮)的合成［J］.上海第一醫(yī)學院學報，1984，11(4):312-313.

［7］ 胡春弟，張 杰.丹皮酚的藥理作用及合成研究進展［J］.化學與生物工程，2009，26(8):16-18.

［8］ 鄧桂鳳，姚彤煒.頂空氣相色譜法測定鹽酸格拉司瓊中硫酸二甲酯殘留量［J］.浙江大學學報(醫(yī)學版)，2008，37(2):156-158.

［9］ 吳平谷.大口徑毛細管柱氣相色譜法測定土壤中硫酸二甲酯含量［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，199，8(6):346-347.

［10］李小娟，馬永建.工作場所空氣中硫酸二甲酯的氣相色譜快速測定［J］.中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2010，23(4):301-302.

［11］覃宣富，鄒曉莉，黎源倩，等.氣相色譜-電子捕獲檢測測定環(huán)境樣品中的硫酸二甲酯含量［J］.四川大學學報(醫(yī)學版)，2010，41(5):877-880.

［12］段正康，劉平樂，熊 鷹，等.甲胺磷原油中硫酸二甲酯的正相高效液相色譜分析［J］.湘潭大學自然科學學報，1999，21(3):40-41.

［13］國家技術監(jiān)督局.GB/T 17077-1997車間空氣中硫酸二甲酯的溶劑解吸液相色譜測定方法［S］.北京:中國標準出版社，2004.

［14］張淑琴，聶 莉.車間空氣中硫酸二甲酯的高效液相色譜測定方法［J］.衛(wèi)生研究，1992，21(2):73-75.