崔倩倩，蔡圣朝，曹云燕，費(fèi)愛(ài)華，朱才豐，徐 雯

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬針灸醫(yī)院，安徽 合肥 230061）

卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）是一種常見(jiàn)的腦血管病并發(fā)癥，表現(xiàn)為多種精神和軀體癥狀的復(fù)雜的情感精神障礙性疾病，既不同于一般抑郁癥，又不同于一般抑郁心情，通常被定義為“卒中后抑郁狀態(tài)”，臨床以情緒控制能力差和（或）肢體活動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)。腦卒中患者的抑郁狀態(tài)發(fā)生率較高，其患病率為30%～35%［1］。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PSD與神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常有關(guān)，是病灶破壞了去甲腎上腺素能（noradrenergic，NE）和5－羥色胺（5－h(huán)ydroxytryptamine，5－HT））神經(jīng)細(xì)胞及其通路，使這兩種遞質(zhì)低下而致抑郁［2］。臨床上目前多使用抗抑郁藥來(lái)控制PSD，但抗抑郁藥物有較多的不良反應(yīng)。亦有相關(guān)的中藥可治療PSD［3－4］，但長(zhǎng)期服用亦可致肝腎損害。針刺作為一種“綠色療法”正日益受到重視，大量臨床對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)針灸治療PSD有一定的療效［5］。前期臨床研究表明，針刺人中、雙側(cè)合谷、雙側(cè)太沖可治療PSD［6］。針刺治療PSD的基礎(chǔ)研究還不夠深入，其改善作用與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）mRNA 和磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4，PDE4）mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

CREB是一種選擇性結(jié)合cAMP反應(yīng)元件的核蛋白，調(diào)控多種基因的表達(dá)。研究［7－8］表明CREB的磷酸化有利于治療相關(guān)血管疾病和具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能。另外，CREB具有調(diào)節(jié)多種復(fù)雜記憶方式的生物學(xué)功能，是長(zhǎng)期記憶形成過(guò)程中重要的調(diào)制器［9］。特別是CREB可以參與阿片類(lèi)物質(zhì)依賴(lài)的形成［10］。

PDE具有水解細(xì)胞內(nèi)第二信使（cAMP和cGMP）的功能，從而終結(jié)其所傳導(dǎo)的生化作用。PDE4是PDE家族的成員之一，主要在神經(jīng)細(xì)胞和炎性細(xì)胞內(nèi)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的功能有密切的關(guān) 系［11］。 研 究［12－13］表 明 PDE4 的 抑 制 劑 可治療老化相關(guān)疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

本研究擬通過(guò)觀察行氣調(diào)神針刺療法（針刺人中，雙側(cè)合谷、雙側(cè)太沖）對(duì)PSD模型大鼠左前皮質(zhì)及海馬CREB和PDE4mRNA表達(dá)的干預(yù)作用，初步闡明PSD的發(fā)病機(jī)制及行氣調(diào)神針刺療法的作用機(jī)制，為其治療PSD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠80只，8月齡，體質(zhì)量（300±50）g，購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2008－0004。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后行曠野實(shí)驗(yàn)行為評(píng)分，將水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)總分低于30分或高于120分的動(dòng)物予以剔除。

1.2 藥品及試劑 Trizol試劑：Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑：美國(guó)Thermo公司；瓊脂糖凝膠：上?；蚬?；DNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；溴化乙錠：美國(guó)Sigma公司；鹽酸氟西汀膠囊：禮來(lái)蘇州制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20080016。

1.3 主要儀器 PCR儀（S1000）、凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc）和水平凝膠電泳系統(tǒng)：Bio－Rad公司；冷凍離心機(jī)（5417R）：德國(guó)Eppendorf公司；紫外觀察燈：美國(guó)SIM公司；TPM－900型 Morris水迷宮：北京友誠(chéng)嘉業(yè)生物科技有限公司；HZQ－C空氣振蕩儀：黑龍江省哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；HPX－9052 MBE型數(shù)顯電熱恒溫箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 80只大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分組，20只作為正常組，其余60只用于復(fù)制腦缺血模型。1周后行Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分以判斷腦缺血模型是否復(fù)制成功，結(jié)果51只大鼠模型復(fù)制成功，7只大鼠死亡，2只大鼠模型復(fù)制不成功。隨機(jī)將模型復(fù)制成功的動(dòng)物分為模型組、針刺組（行氣調(diào)神針刺療法）、西藥組（鹽酸氟西汀治療），每組17只，在PSD模型復(fù)制及治療期間均有大鼠死亡，最后每組用于檢測(cè)的大鼠均為11只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循2006年國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)規(guī)定。

2.2 PSD模型復(fù)制 通過(guò)電凝大鼠大腦中動(dòng)脈引起局部腦缺血［14］結(jié)合改良 Willner P等［15］方法（慢性應(yīng)激＋孤養(yǎng)法）復(fù)制PSD模型。①腦缺血模型復(fù)制。10%水合氯醛（4ml／kg）腹腔麻醉，在顳骨前下緊鄰顴弓前份上緣部位開(kāi)窗，暴露0.5cm×0.5cm的骨窗。凝閉位于嗅束至大腦下靜脈之間的大腦中動(dòng)脈主干及周?chē)?dòng)脈分支。②慢性應(yīng)激＋孤養(yǎng)法。大鼠在3周內(nèi)安排7種應(yīng)激方法，每天隨機(jī)選取一種應(yīng)激方法。正常組除第1天、第8天、第15天禁水，次日進(jìn)行蔗糖水試驗(yàn)外，均正常進(jìn)食、飲水。模型組、針刺組、西藥組單籠飼養(yǎng)，開(kāi)始21d的慢性應(yīng)激，包括3次24h禁水，3次24h禁食，3次通宵照明，3次4℃冰水游泳5min，3次45℃恒溫箱熱烘5min，3次夾尾1min，3次30min高速水平振蕩（160次／min），每種應(yīng)激方法每周1次，隨機(jī)選取。應(yīng)激結(jié)束后繼予以單籠飼養(yǎng)16d。

2.3 PSD模型檢測(cè) 通過(guò)蔗糖水消耗量（測(cè)試動(dòng)物對(duì)獎(jiǎng)賞的欣快反應(yīng)）、敞箱測(cè)定（垂直活動(dòng)反映大鼠的興趣高低，水平活動(dòng)反映大鼠的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性水平）和水迷宮測(cè)定（定位航行試驗(yàn)反映大鼠的學(xué)習(xí)能力情況，空間探索試驗(yàn)反映大鼠的空間記憶能力），在慢性應(yīng)激的第1天和治療的第21天，以及治療6周結(jié)束后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Zea Longa等［15］制定的6級(jí)評(píng)分法：無(wú)功能障礙為0分；不能伸展前肢為1分；向一側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分；向一側(cè)傾倒為3分；無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)抑制為4分；死亡為5分。評(píng)分為1～4分即模型復(fù)制成功。

2.4 治療方法

2.4.1 針刺組：慢性應(yīng)激的第8天開(kāi)始，針刺SD大鼠的“人中”、雙側(cè)“合谷”、雙側(cè)“太沖”，取穴標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［16］，大鼠針刺后置于鼠架上留針15min，期間以捻轉(zhuǎn)手法行針1次，每日1次，14d為1個(gè)療程，療程間隔1d，共3個(gè)療程。

2.4.2 西藥組：慢性應(yīng)激的第8天開(kāi)始，予0.231 g／ml氟西汀混懸液10ml／kg（即2.31mg／kg，相當(dāng)于成人臨床用量的7倍）灌胃治療，每日1次，療程與針刺組相同。

2.4.3 模型組和正常組：應(yīng)激第8天開(kāi)始，予以生理鹽水10ml／kg灌胃，每日1次。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)方法 治療結(jié)束后，將大鼠斷頭取腦，置于冰面上分離左前皮質(zhì)及左側(cè)海馬，放于－70℃冰箱備用。RT－PCR實(shí)驗(yàn)：根據(jù)文獻(xiàn)確定β－actin、CREB及PDE4mRNA的PCR引物序列（見(jiàn)表1），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用Trizol一步法提取各組大鼠左前皮質(zhì)與海馬總mRNA，紫外分光光度計(jì)定量mRNA純度較好。反應(yīng)總體積20μl，含PCR混合物10μl，RT樣品2μl，無(wú)RNA酶水6.4μl，上游引物、下游引物各0.8μl。逆轉(zhuǎn)錄42℃，60min，70℃，5min；開(kāi)始 PCR 循環(huán)：變性94℃，30s，退火52℃，30s，延伸72℃，45s，共35個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)于72℃繼續(xù)反應(yīng)10min。取5μl PCR產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，20min后采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并進(jìn)行拍照。

表1 β－actin、CREB及PDE4mRNA引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。各組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠皮質(zhì)及海馬部位的CREB mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01），PDE4 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，西藥及針刺組大鼠左前皮質(zhì)及海馬CREB mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.01），PDE4mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組大鼠左前皮質(zhì)及海馬CREB和PDE4mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠左前皮質(zhì)及海馬CREB和PDE4mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與西藥組比較，△△P＜0.01。

正常 11 1.040±0.019 0.697±0.012 0.263±0.010 0.382±0.012模型 11 0.587±0.022＊＊ 0.498±0.014＊＊ 0.774±0.026＊＊ 0.682±0.024＊＊西藥 11 0.852±0.012＃＃ 0.743±0.014＃＃ 0.371±0.013＃＃ 0.412±0.012＃＃針刺11 0.865±0.024＃＃0.726±0.014＃?！鳌?.275±0.013＃?！鳌?.416±0.016＃＃

圖1 各組大鼠CREB、PDE4表達(dá)水平比較（RT－PCR法）

4 討論

PSD屬于中醫(yī)學(xué)中風(fēng)后“郁證”范疇。中醫(yī)學(xué)對(duì)此早已有較多的認(rèn)識(shí)，例如《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有較多關(guān)于情志致郁的論述，至明代《醫(yī)學(xué)正傳》首先采用“郁證”這一病名。自此之后，已逐漸把情志之郁作為“郁證”的主要內(nèi)容。PSD的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，目前多認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常有關(guān)，多種環(huán)境因素及認(rèn)知障礙、軀體功能障礙等生物因素的疊加作用也促使PSD的發(fā)生，而腦損傷的部位與PSD的發(fā)生也有密切的關(guān)系［17］。有研究認(rèn)為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子－2表達(dá)水平下降也是引起PSD的原因之一［18］。目前抑郁癥的生化機(jī)制研究已從神經(jīng)遞質(zhì)及其受體轉(zhuǎn)移到信號(hào)傳導(dǎo)通路上，現(xiàn)多集中在抑郁癥患者的G蛋白變化及相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路方面，而目前G蛋白介導(dǎo)的信息傳導(dǎo)通路的研究熱點(diǎn)是環(huán)磷酸腺苷通路和磷脂酰肌醇通路。本研究主要從cAMP通路入手觀察行氣調(diào)神針?lè)ㄖ委烶SD的機(jī)制。

腦卒中可導(dǎo)致臟腑虛弱、情志內(nèi)傷、肝氣郁結(jié)，久則血瘀、痰濁等實(shí)邪內(nèi)生，導(dǎo)致氣機(jī)逆亂，擾及腦神、心神，致使腦失所控、神明失用。除了出現(xiàn)肢體活動(dòng)障礙癥狀外，亦有精神恍惚、心神不寧、悲憂善哭、喜怒無(wú)常、失眠健忘等郁證表現(xiàn)［19］。本課題組通過(guò)長(zhǎng)期臨床總結(jié)，提出氣機(jī)失調(diào)、腦神失控為PSD的主要病機(jī)，確立行氣調(diào)神針?lè)镻SD的治療大法。

本針刺療法選用合谷（雙）、太沖（雙）、人中。合谷為手陽(yáng)明大腸經(jīng)原穴，陽(yáng)明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，該穴具有調(diào)和氣血、行氣開(kāi)竅、通降氣機(jī)之效。太沖為足厥陰肝經(jīng)原穴，有通經(jīng)活絡(luò)、舒肝理氣、平肝熄風(fēng)之效?！鹅`樞·九針十二原》云：“五臟有疾，當(dāng)取之十二原。”《席弘賦》亦云：“手連肩脊痛難忍，合谷針時(shí)要太沖。”合谷、太沖并用，即“開(kāi)四關(guān)”。合谷屬陽(yáng)，主氣，太沖屬陰，主血；二穴相配，一陰一陽(yáng)，可調(diào)節(jié)人體氣血陰陽(yáng)的升降平衡。研究認(rèn)為針刺雙側(cè)合谷和太沖可激活腦部多個(gè)區(qū)域，且并非是單獨(dú)針刺兩穴所激活腦區(qū)的簡(jiǎn)單疊加［20］。人中穴為督脈經(jīng)穴，亦為手足陽(yáng)明經(jīng)和督脈的交會(huì)穴，具有開(kāi)竅醒神和安神定志的作用。太沖、合谷、人中三穴合用，共奏行氣調(diào)神之效。

PDE4作為cAMP的特異性水解酶，可以在不同的時(shí)間和空間調(diào)節(jié)cAMP濃度，對(duì)cAMP介導(dǎo)的信號(hào)反應(yīng)區(qū)域化起重要的作用。而作為胞內(nèi)第二信使的cAMP，是由cAMP信號(hào)通路上腺苷酸環(huán)化酶催化ATP生成，其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝生長(zhǎng)和分裂、記憶形成、神經(jīng)傳遞、基因表達(dá)等作用。另外cAMP可激活蛋白激酶A和蛋白激酶C亞基進(jìn)入核內(nèi)，使CREB轉(zhuǎn)錄因子特異的絲氨酸殘端磷酸化而活化，磷酸化的CREB可以與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。這些基因的一些蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)學(xué)習(xí)記憶是必不可少的，因此在學(xué)習(xí)記憶中cAMP有非常重要的作用。因此通過(guò)抑制PDE4來(lái)增加cAMP的含量，促使CREB磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)再生和神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)而發(fā)揮抗抑郁作用。

本研究結(jié)果顯示，PSD大鼠左前皮質(zhì)及海馬CREB mRNA的表達(dá)顯著減少，PDE4mRNA的表達(dá)顯著高于其他各組；行氣調(diào)神針刺療法和鹽酸氟西汀膠囊具有調(diào)節(jié)PSD大鼠左前皮質(zhì)及海馬CREB mRNA和PDE4mRNA表達(dá)的作用。本研究結(jié)果可為行氣調(diào)神針刺療法替代抗抑郁藥物治療PSD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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