陳以軍，任亞碩，吳德玲，張 偉，汪天明

（1．六安市立醫(yī)院，安徽 六安 237001；2．現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230038；3．安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230038；安徽中醫(yī)藥大學(xué)科技處，安徽 合肥 230038）

醉魚草果實藥材是馬錢科植物醉魚草（BuddlejalindleyanaFort．）的果實，具有祛風(fēng)除濕、止咳化痰、散瘀之功效［1］。本課題組已從中發(fā)現(xiàn)并報道了多種成分及其生物活性［2－5］，包括多種黃酮類成分，其中木犀草素作為一種常見黃酮，是其抗菌消炎作用的主要活性成分［6－7］，具有較強的抗炎抗氧化活性［8］。另外它還具有抗腫瘤、防治心血管疾病以及保護心肌細胞等多種藥理活性［9－11］。經(jīng)查閱相關(guān)文獻，木犀草素廣泛存在于醉魚草屬植物中，前期系統(tǒng)分離實驗也從醉魚草果實中分離得到木犀草素等多種黃酮類成分［4］，但醉魚草果實中木犀草素含量測定的方法尚未見報道。故筆者參考相關(guān)文獻［12－13］，采用反相高效液相色譜法建立了醉魚草果實中木犀草素含量的測定方法，以期為醉魚草這一傳統(tǒng)藥用資源的系統(tǒng)開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 高效液相色譜儀：美國 Agilent 1260（二元泵：G1312C，柱溫箱：G1316A，DAD檢測器：G4212B，自動進樣器：G1329B）；AB135－S十萬分之一分析天平：瑞士 METTLER TOLEDO；HH－S恒溫水浴鍋：江蘇金壇市國勝實驗儀器廠；FZ－02型高速中藥粉碎機：浙江省溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠；AS3120超聲清洗儀：天津奧特塞恩斯；Milli－Q一體式超純水系統(tǒng)：德國默克密理博。

1．2 試藥 木犀草素：中國藥品生物制品檢定所，批號111520－200504；醉魚草果實：2008年12月采自安徽舒城萬佛山，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為馬錢科植物醉魚草（BuddlejalindleyanaFort．）的果實；甲醇：色譜純；水：實驗室自制超純水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Welch Ultimate AQ－C18柱（250mm×4．6mm，5μm），流動相：甲醇－水－乙酸（60∶40∶2），流速：1ml／min；檢測波長：350nm；柱溫：25℃；進樣量：20μl。在本色譜條件下，木犀草素的理論塔板數(shù)大于3 000，其色譜峰與共存物質(zhì)色譜分離度大于1．5。木犀草素（對照品）及醉魚草果實（供試品）的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）與供試品（B）溶液的反相高效液相色譜圖

2．2 對照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36h以后的木犀草素對照品2．16mg，加適量甲醇溶解，定容至100ml，即得濃度為21．6μg／ml的木犀草素對照品溶液。

2．3 供試品溶液的制備 精密稱取醉魚草果實粗粉1g，加甲醇20ml回流提取1h，提取3次，合并濾液，定容至100ml，用微孔濾膜（0．45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．4 方法學(xué)考察

2．4．1 線性關(guān)系考察：精密吸取“2．2”項下木犀草素對照品溶液，分別進樣2、5、8、10、15、20μl，測定峰面積，以峰面積積分值（y）為縱坐標，木犀草素的進樣量（x）為橫坐標，繪制標準曲線。得木犀草素線性回歸方程為：y＝3 610．4x－5．22，r＝0．999 9。結(jié)果表明，木犀草素進樣量在0．043 2～0．432 0μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2．4．2 精密度試驗：精密吸取對照品溶液10μl，重復(fù)進樣6次，記錄各次木犀草素的峰面積值，RSD＝0．33%。表明儀器精密度良好。

2．4．3 重復(fù)性試驗：精密稱取醉魚草粗粉1g，同“2．3”項下方法制備供試品溶液6份，在擬定的色譜條件下，進樣分析，測定峰面積，計算木犀草素的平均含量為0．096%，RSD＝1．28%。表明重復(fù)性良好。

2．4．4 穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12h測定，記錄木犀草素峰面積值，其RSD＝1．17%。表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2．4．5 加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的醉魚草果實粗粉1g，共6份，置50ml圓底燒瓶中，分別精密加入與藥材含量相當?shù)哪鞠菟貙φ掌?，然后按?．3”項步驟的供試品溶液制備方法制備，測定。結(jié)果表明，所建立的分析方法準確度良好。見表1。

表1 加樣回收率試驗

2．5 樣品含量測定 按“2．3”項下步驟操作，制備供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件，測得供試品中木犀草素含量為0．093%、0．095%、0．096%，平均含量為0．095%。

3 討論

本實驗中采用二極管陣列檢測器，在190～400 nm波長范圍內(nèi)對供試品及對照品溶液進行光譜掃描，結(jié)果供試品溶液與對照品溶液木犀草素對應(yīng)峰的最大吸收波長均為350nm，且基本無干擾，因此選擇350nm作為檢測波長。流動相采用甲醇－水系統(tǒng)，并加入一定比例的乙酸，抑制其拖尾現(xiàn)象，最終選定流動相為甲醇－水－乙酸（60∶40∶2）。此時有良好的分離度，峰形尖銳，分析時間在25min以內(nèi)。確定測定條件之后，又對醉魚草果實樣品的提取溶劑進行考察，分別選取水，不同濃度的乙醇、甲醇、乙酸乙酯等多種溶劑進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇回流提取時，測得木犀草素含量最高。

醉魚草為民間常用中草藥，但其果實研究屬于空白，不利于醉魚草資源的綜合開發(fā)。本研究通過高效液相色譜法建立了醉魚草果實中木犀草素的含量測定方法，結(jié)果顯示該方法簡便、快速、結(jié)果可靠、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，為醉魚草果實中黃酮類成分的研究提供了參考依據(jù)。由醉魚草果實的高效液相色譜圖可知，木犀草素之前的色譜峰對應(yīng)成分含量較高，且極性比木犀草素大。由于本實驗所選波長主要是為了檢測黃酮類成分，故推測其對應(yīng)成分可能為黃酮苷類化合物。故本實驗對醉魚草果實的系統(tǒng)分離工作也具有一定的指導(dǎo)意義。

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