王 莖，曾永蕾，武鳳琴，孫瑞瑞，陳 靜

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥 230038）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）病變機(jī)制較為復(fù)雜。近年來研究表明，心室重塑是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵［1］，而免疫和炎性遞質(zhì)在心力衰竭的發(fā)生及進(jìn)展過程中起著重要的作用［2］。腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factorα，TNF－α）、白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）作為炎性細(xì)胞因子，可長期影響心肌組織的重塑，參與CHF的病理生理過程［3］。艾灸對免疫系統(tǒng)［4］和心血管系統(tǒng)［5］具有良好的調(diào)整作用，且艾灸具有容易操作、不良反應(yīng)少、作用顯著等優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)以心室質(zhì)量指數(shù)及TNF－α、IL－6mRNA表達(dá)水平作為觀測指標(biāo)，擬從免疫炎癥角度，初步探討艾灸肺俞、心俞對CHF心室重塑的影響機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠35只，雄性，SPF級，體質(zhì)量180～220g，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要儀器 ABI－2720型PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Tanon 3500型電子凝膠成像系統(tǒng)：上海天能公司。

1.3 試劑和藥物 RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及 TNF－α、IL－6、β－actin特異性引物均為江蘇省南京諾維贊公司產(chǎn)品，其序列及擴(kuò)增長度見表1。阿霉素（adriamycin，ADR）：浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號 H33021980，每支10mg。卡托普利：上海旭東海普藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號H31020564，每片25mg。

表1 TNF－α、IL－6、β－actin擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物長度

2 方法

2.1 模型復(fù)制 采用ADR隔日腹腔注射的方法［6］復(fù)制CHF模型，ADR長期小劑量累積給藥，可誘導(dǎo)嚴(yán)重的CHF模型，且可靠簡便［7］。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行模型復(fù)制，劑量依次為1、2、3、4mg／kg，每個(gè)劑量給藥2次，依次遞增，隔日1次，共8次，累積量20mg／kg，持續(xù)15d。正常喂養(yǎng)3周，每日密切觀察大鼠精神狀態(tài)、活動、進(jìn)食飲水量、體質(zhì)量及呼吸頻率變化。以左心室濕質(zhì)量／體質(zhì)量比值和右心室濕質(zhì)量／體質(zhì)量比值分別代表左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）和右心室質(zhì)量指數(shù)（right ventricular mass index，RVMI），以反映心室重構(gòu)情況［8］，結(jié)合大鼠一般情況及心率，作為模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)［9］。

2.2 動物分組 將35只大鼠隨機(jī)抽取28只用于模型復(fù)制，另7只作正常組。正常喂養(yǎng)3周，將28只模型大鼠分為4組，即模型組、西藥組、艾灸組、艾灸加西藥組。

2.3 治療方案 模型復(fù)制3周后開始進(jìn)行。

2.3.1 西藥組：給予卡托普利混懸液（25mg／kg）灌服，每日1次，連續(xù)3周。

2.3.2 艾灸組：取雙側(cè)肺俞、心俞，定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜［10］，行艾條溫和灸，用特制小艾條在距離穴位1～2cm處施灸，每次每穴各灸15min，每日1次，共3周。

2.3.3 艾灸加西藥組：先給予卡托普利（25mg／kg）混懸液灌服，再用艾條溫和灸肺俞、心俞，每日1次，連續(xù)3周。

2.3.4 模型組和正常組：正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何治療。期間注意觀察各組大鼠行為特征。

2.4 指標(biāo)觀察

2.4.1 心室肌組織取材與保存：將大鼠稱質(zhì)量，用4%戊巴比妥鈉溶液（40mg／kg）腹腔注射麻醉后，將其仰臥固定于鼠臺，腹主動脈放血處死，開胸暴露心臟，結(jié)扎出入心臟大血管，于右心室剪一小口，用4℃預(yù)冷的生理鹽水逆行灌注，沖洗心室腔至沖洗液無血性液體。取出心臟，用清潔濾紙吸干水分后，分別稱取左、右心室（包括室間隔）濕質(zhì)量，全過程于冰浴中進(jìn)行。計(jì)算左、右心室濕質(zhì)量／體質(zhì)量比值，為心室質(zhì)量指數(shù)。處理后心肌凍存于液氮中，液氮冷凍后轉(zhuǎn)存于－70℃超低溫冰箱，用于RT－PCR檢測。

2.4.2 RT－PCR 法檢測心肌組織TNF－α、IL－6 mRNA水平：①總RNA提取：按所購總RNA抽提試劑盒說明進(jìn)行。②逆轉(zhuǎn)錄：取2μl RNA溶液做模板，總反應(yīng)體積為55μl，具體步驟按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。③PCR擴(kuò)增 TNF－α及IL－6：PCR反應(yīng)總體積50μl，預(yù)變性95℃，3min，變性98℃，10s，退火58℃15s；延伸72℃，30s；30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后再72℃延伸1min。β－actin反應(yīng)條件，同目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)條件。1%瓊脂糖凝膠電泳，在電子凝膠成像儀上檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果以TNF－α及IL－6與同組β－actin電泳帶光密度的比值，作為該組標(biāo)本的基因表達(dá)的相對值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析前對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組之間均數(shù)比較采用LSD分析（方差齊時(shí)）或Tamhane'sT2分析（方差不齊時(shí)）。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 從第8天開始，與正常組比較，模型組大鼠陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、倦臥、反應(yīng)遲鈍、呼吸困難，體質(zhì)量下降等現(xiàn)象。從治療第2周開始，治療組大鼠氣喘、食欲下降、萎靡倦怠等有不同程度改善，大鼠反應(yīng)性提高；模型組上述癥狀依然存在，總體上有加重趨勢；正常組大鼠活動、反應(yīng)靈敏性如常，體質(zhì)量上升。

3.2 各組大鼠心室肌質(zhì)量指數(shù)比較 與正常組比較，模型組大鼠LVMI和RVMI顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組、艾灸組、艾灸＋西藥組LVMI和RVMI顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）。結(jié)果表明艾灸能顯著降低心室肌質(zhì)量指數(shù)。見表2。

表2 各組大鼠心室肌質(zhì)量指數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠心室肌質(zhì)量指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

正 常7 2.136±0.252 0.534±0.063模 型 7 2.823±0.314＊＊ 0.724±0.080＊＊西 藥 7 2.450±0.291△ 0.615±0.073△艾 灸 7 2.490±0.355△ 0.627±0.090△艾灸＋西藥 7 2.194±0.280△△ 0.550±0.070△△

3.3 各組大鼠心肌組織 TNF－α、IL－6mRNA 相對表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠TNF－α、IL－6mRNA相對表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，3個(gè)治療組 TNF－α、IL－6mRNA 相對表達(dá)水平顯著降低，（P＜0.01）。見表3、圖1。

表3 各組大鼠心肌組織 TNF－α、IL－6mRNA相對表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織 TNF－α、IL－6mRNA相對表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

正 常7 1.005±0.128 1.018±0.376模 型 7 5.024±0.640＊＊ 5.189±0.749＊＊西 藥 7 2.439±0.346△△ 2.546±0.344△△艾 灸 7 2.520±0.471△△ 2.988±0.471△△艾灸＋西藥 7 2.334±0.327△△ 2.414±0.460△△

圖1 RT－PCR檢測各組大鼠心肌組織TNF－α、IL－6mRNA相對表達(dá)水平

4 討論

關(guān)于CHF發(fā)病和心室重塑形成機(jī)制的研究，正不斷深入。近年研究發(fā)現(xiàn)，CHF不僅存在血流動力學(xué)紊亂，更重要的是激活了包括交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)在內(nèi)的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)［11－12］。炎性細(xì)胞因子在CHF心室重塑的演變過程中，扮演著非常重要的角色。高水平表達(dá)的炎性細(xì)胞因子TNF－α、IL－6，作用于細(xì)胞膜上的特殊受體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，引起心臟間質(zhì)纖維化、心肌收縮力下降和心室重構(gòu)等。血漿中TNF－α、IL－6水平增高的患者，存在病死率增高的趨勢。TNF－α、IL－6可長期影響心肌重塑，參與CHF的病理生理過程。它們通過促使左心室擴(kuò)大、降低左心室收縮能力和誘導(dǎo)凋亡使心臟功能減退［3］。

本實(shí)驗(yàn)采用ADR隔日腹腔注射的模型復(fù)制方法。有研究［7］證實(shí)，ADR作為一種高效蒽醌類廣譜抗腫瘤藥物，其心臟毒性作用機(jī)制表現(xiàn)為抑制谷胱甘肽過氧化物酶活性，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響線粒體的能量代謝，隨其劑量在動物體內(nèi)積累增加而導(dǎo)致心肌細(xì)胞變性壞死，從而引起嚴(yán)重的心力衰竭，多用于復(fù)制慢性心力衰竭模型。而腹主動脈半縮窄術(shù)構(gòu)建的是舒張性心力衰竭模型［6］，手術(shù)操作難度大，縮窄程度與結(jié)扎很難一致，病死率較高。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，ADR隔日腹腔注射的方法復(fù)制模型的效果較好，病死率低。

心俞是心的背俞穴，具有調(diào)理氣血、養(yǎng)心安神、寧心定志之功，為歷代醫(yī)家治療心胸病癥之要穴。現(xiàn)代研究［13］表明，針刺不僅能有效地緩解患者的癥狀，而且能影響血流動力學(xué)參數(shù)。肺俞是肺的背俞穴，具宣肺通氣、疏調(diào)上焦之功?，F(xiàn)代研究［14］證明，針刺肺俞穴能明顯改善肺功能，增大肺通氣量，主要治療呼吸系統(tǒng)疾病。肺與心表現(xiàn)為氣血關(guān)系，故肺俞可用于治療與氣血關(guān)系最為相關(guān)的心血管疾病。

艾灸肺俞、心俞能顯著改善心功能和降低血漿內(nèi)皮素水平［15］，說明艾灸對神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)有良性調(diào)整作用。本課題在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察心室質(zhì)量指數(shù)，并檢測心室肌 TNF－α、IL－6 mRNA表達(dá)水平，探討艾灸對慢性心力衰竭心室重塑的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)治療組心室質(zhì)量指數(shù)及 TNF－α、IL－6mRNA 表達(dá)水平顯著降低。有研究［16］表明，艾灸刺激穴位后，可引起機(jī)體神經(jīng)－內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的變化，釋放某些生物活性物質(zhì)，激活靶細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究提示，艾灸肺俞、心俞穴對緩解CHF心室重塑、改善心肌肥厚有著積極意義，為臨床治療CHF拓寬了思路。有關(guān)艾灸對CHF心室重塑的影響及其相關(guān)的神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入探討。

［1］王愛民，王立君.心室重塑的研究進(jìn)展［J］.疑難病雜志，2008，7（2）：123－125.

［2］Lips DJ，deWindt LJ，van Kraaij DJ，et al.Molecular determinants of myocardial hypertrophy and failure：alternative pathways for beneficial and maladaptive hypertrophy［J］.Eur Heart J，2003，24（10）：883－896.

［3］Parish RC，Evans JD.Inflammation in chronic heart failure［J］.Ann Pharmacother，2008，42（7）：1002－1016.

［4］張傳英.艾灸調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能研究概況［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，28（2）：60－61.

［5］李莎莎，肖雪，王躍生，等.血瘀證與活血化瘀研究進(jìn)展［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24（1）：102－104.

［6］王玉敏，馬琰巖，高俊虹，等.黃芪總提取物及其有效成分改善阿霉素致心衰的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（7）：208－212.

［7］鄧青秀，彭成.中醫(yī)藥心力衰竭動物模型的研究現(xiàn)狀［J］.四川動物，2011，30（2）：296－300.

［8］楊冬花，付蓉，卞震炯.益氣溫陽活血方對慢性心衰大鼠心室重構(gòu) NF－κB表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（1）：77－80.

［9］李梅秀，田國忠，歐葉濤，等.大鼠阿霉素慢性心衰模型的制備與心衰指標(biāo)的判定［J］.解剖學(xué)研究，2005，3（27）：176－178.

［10］李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：327－329.

［11］中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會，中華心血管病雜志編輯委員會.慢性心力衰竭診斷治療指南［J］.中華心血管病雜志，2007，35（12）：1076－1095.

［12］戴閨柱.心力衰竭治療的新問題：神經(jīng)內(nèi)分泌不協(xié)調(diào)［J］.中華心血管病雜志，2003，31（1）：1－2.

［13］郭俐宏，陳德森，方偉，等.電針內(nèi)關(guān)、心俞對大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用［J］.針灸臨床雜志，2009，25（11）：46－48.

［14］吳兆利.肺俞穴古今研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34（4）：504－505.

［15］王莖，曾永蕾，江莉，等.艾灸對慢性心衰模型大鼠心功能及ET的影響［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（4）：421－423.

［16］王少錦.針灸效應(yīng)與細(xì)胞信息傳導(dǎo)關(guān)系的初步探討［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（11）：31－33.