朱加應(yīng)， 張廣云， 王建怡， 袁 平， 胡 曉△

谷氨酸(glutamate，Glu)廣泛分布于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)，是腦內(nèi)含量最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸可塑性和介導(dǎo)突觸興奮性活動(dòng)等方面發(fā)揮著重要的作用。Glu的受體，特別是N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)在突觸可塑性中發(fā)揮了重要作用，對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、分化、遷移、成熟、修復(fù)等方面具有重要影響［1］。但過多Glu積聚可導(dǎo)致Glu受體的過度激活引起鈣超載，從而激活神經(jīng)毒性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，啟動(dòng)一系列細(xì)胞反應(yīng)，包括線粒體膜的去極化，氧自由基的產(chǎn)生和蛋白酶的激活，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，這就是Glu的興奮毒性損傷［2］。不少研究報(bào)道多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展與Glu的興奮毒性損傷密切相關(guān)。

雌激素是內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的類固醇激素，除具有傳統(tǒng)調(diào)控生殖系統(tǒng)的功能及其生長(zhǎng)發(fā)育作用外，雌激素及其受體還可參與CNS的多種功能調(diào)節(jié)并發(fā)揮保護(hù)作用。普遍認(rèn)為，雌激素的細(xì)胞反應(yīng)性和敏感性主要是由2個(gè)不同的雌激素受體(estrogen receptor，ER)亞型介導(dǎo):ERα 和 ERβ。Xia等［3］應(yīng)用選擇性ER調(diào)節(jié)劑和ER特異性拮抗劑，發(fā)現(xiàn)雌激素減輕Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷可能主要依賴ERα完成，也有研究發(fā)現(xiàn)雌二醇刺激發(fā)育中海馬神經(jīng)細(xì)胞Glu能突觸的形成是通過ERα介導(dǎo)的［4］。鑒于目前對(duì)其具體作用機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，應(yīng)用雌激素和ERα重組慢病毒干預(yù)該損傷模型，觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，檢測(cè)NMDAR1和囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白1(vesicular glutamate transporter protein 1，VGLUT1)mRNA和蛋白表達(dá)，探討雌激素和ERα對(duì)Glu誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的可能機(jī)制，期望為相關(guān)領(lǐng)域疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。

材料和方法

1 病毒和動(dòng)物

空慢病毒(V-RFP-flag)及ERα重組慢病毒(VERα-RFP-flag)由貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存;C57BL/6新生鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 主要試劑

SYBR Master Mix試劑盒、Trizol和cDNA合成試劑盒購自TaKaRa;兔抗小鼠NMDAR1多克隆抗體、兔抗小鼠VGLUT1多克隆抗體及羊抗小鼠Ⅱ抗購自Santa Cruz;小鼠抗人ERα單克隆抗體購自LifeSpan Biosciences;羊抗兔Ⅱ抗(攜帶FITC綠色熒光)和小鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)抗體購自博士德公司;蛋白定量試劑盒購自HyClone-Pierce;ECL-Plus試劑盒購自Amersham;PVDF膜購自Bio-Rad;β-雌二醇購自TCI;L-谷氨酸購自北京索萊寶科技有限公司;D-Hank′s緩沖液、胰蛋白酶、DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自 Hy-Clone;B27培養(yǎng)基購自Gibco;L-多聚賴氨酸購自Sigma;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

3 引物合成

引物合成由大連寶生物工程有限公司完成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4 方法

4.1 Glu誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的建立及鑒定 將出生24 h內(nèi)的C57BL/6新生鼠置于75% 乙醇中消毒3 min，剝離新生鼠的大腦皮層組織放于預(yù)冷DHank′s緩沖液中，按以往實(shí)驗(yàn)方法原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞并用NSE免疫組化方法鑒定神經(jīng)細(xì)胞純度［5］。用D-Hank′s液洗2遍，并換上無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用加入含50 μmol/L Glu的 D-Hank′s緩沖液誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷并對(duì)該模型進(jìn)行鑒定［6］。

4.2 V-ERα-RFP-flag感染Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞用MOI=7的V-RFP-flag感染Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞［7］。在倒置顯微鏡下每天觀察紅色熒光的表達(dá)情況，感染72 h可見到紅色熒光明顯表達(dá)。用MOI=7的V-ERα-RFP-flag感染 Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞，VERα-RFP-flag感染組和 V-RFP-flag感染組各設(shè)5孔，感染后3 d用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting方法檢測(cè)2組細(xì)胞中ERα mRNA和蛋白表達(dá)。

4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)受感染神經(jīng)細(xì)胞中ERα mRNA和蛋白表達(dá) 用Trizol提取的神經(jīng)細(xì)胞的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)SYBR Master Mix試劑盒的產(chǎn)品說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，β-actin作為內(nèi)參照。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。同時(shí)設(shè)RT質(zhì)控和PCR擴(kuò)增2個(gè)空白對(duì)照。根據(jù)目的基因與內(nèi)參照基因的Ct差值，得到標(biāo)本ERα mRNA的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，用PBS清洗神經(jīng)細(xì)胞，收集細(xì)胞并用裂解液裂解，用細(xì)胞刮刮下裂解產(chǎn)物，14 000 r/min離心5 min去除細(xì)胞碎片。使用蛋白定量試劑盒測(cè)定裂解產(chǎn)物的蛋白濃度并調(diào)整為2 g/L。用SDS-PAGE電泳分離等量的蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜浸入TBST 5%脫脂奶粉中室溫放置1 h，與1∶500稀釋的小鼠抗 ERα抗體和1∶2 500稀釋的抗GAPDH抗體共孵育，4℃過夜。與1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG在室溫下孵育1 h。經(jīng)過多次清洗，用 ECL-Plus試劑盒觀察蛋白條帶。GAPDH作為內(nèi)參照。使用凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算ERα條帶密度/GAPDH條帶密度的相對(duì)值，以測(cè)定蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)5次。

4.4 分組 Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型經(jīng)鑒定構(gòu)建成功后，將細(xì)胞隨機(jī)分為:(1)對(duì)照組:用含有MOI=7的V-RFP-flag無血清培養(yǎng)基感染Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞;(2)雌激素組:加入終濃度為10 nmol/L β-雌二醇的無血清培養(yǎng)基持續(xù)干預(yù)Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞;(3)慢病毒組:用含有MOI=7的V-ERα-RFP-flag無血清培養(yǎng)基感染Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞。每組細(xì)胞各設(shè)5孔，將3組細(xì)胞分別作相應(yīng)處理后放于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后分別檢測(cè)各組的細(xì)胞活性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光法分別檢測(cè)NMDAR1和VGLUT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

4.5 Annexin V-FITC/PI方法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率將各組的神經(jīng)細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶1 mL消化1～3 min，在倒置顯微鏡下觀察消化情況，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中和，將消化好的神經(jīng)細(xì)胞置于低速離心機(jī)上以1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次，每孔收集(1～5)×105細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL propidium iodide，混勻，室溫，避光，反應(yīng) 5～15 min，置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。

4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組神經(jīng)細(xì)胞NMDAR1和VGLUT1 mRNA表達(dá) 方法同4.3中ERα的mRNA檢測(cè)。

4.7 免疫熒光染色檢測(cè)NMDAR1和VGLUT1蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)于蓋玻片處理后的神經(jīng)細(xì)胞，4%甲醛溶液固定，0.4%Triton X-100透化5～15 min，10%BSA封閉1 h后，用兔抗NMDAR1和VGLUT1室溫孵育1 h，對(duì)應(yīng)的熒光Ⅱ抗(1∶100 稀釋)室溫1 h，1 mg/L DAPI作用5 min復(fù)染細(xì)胞核。95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察NMDAR1和VGLUT1的蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)拍攝不同視野的3張圖片，每張圖片隨機(jī)采集5個(gè)不同重疊的高倍視野，輸入圖像分析系統(tǒng)中，測(cè)定每個(gè)視野的積分吸光度(IA)，取5個(gè)視野平均值為該張圖片單位面積的IA值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)

經(jīng)顯微鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞在培養(yǎng)12 h后開始貼壁，24 h后分化生長(zhǎng)成梭形，見圖1A;3 d后可見神經(jīng)細(xì)胞間形成稀疏網(wǎng)絡(luò)，7 d后可見神經(jīng)細(xì)胞胞體飽滿，細(xì)胞核突起光暈明顯，立體感強(qiáng)，軸、樹突細(xì)長(zhǎng)交織成網(wǎng)，見圖1B，此時(shí)期是感染的最佳時(shí)期。

Figure 1.Primarily cultured mouse cerebral cortical neural cells(scale bar=0.1 mm).A:24 h;B:7 d.圖1 小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)

2 神經(jīng)細(xì)胞鑒定

分為鑒定組和對(duì)照組各3孔，對(duì)照組用0.01 mol/L PBS代替NSE抗體，排除假陽性可能。對(duì)照組細(xì)胞不被染色的為陰性細(xì)胞(圖2A);鑒定組為培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞，在染色后胞漿中充滿棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞(圖2B)，以3個(gè)以上視野中陽性神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目占總細(xì)胞的比計(jì)算神經(jīng)元純度，經(jīng)計(jì)數(shù)鑒定組神經(jīng)元純度達(dá)90%以上。

Figure 2.The purity of neurons identified by NSE immunohistochemistry(scale bar=0.1 mm).A:control group;B:identified group.圖2 免疫組化方法鑒定NSE陽性的神經(jīng)元

3 V-ERα-RFP-flag感染神經(jīng)細(xì)胞

MOI=7的V-RFP-flag和V-ERα-RFP-flag感染神經(jīng)細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡觀察下可見到紅色熒光表達(dá)，見圖3。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與VRFP-flag感染的神經(jīng)細(xì)胞相比，感染V-ERα-RFP-flag的神經(jīng)細(xì)胞中ERα mRNA表達(dá)增高(6.237±1.417)×103倍(P＜0.01)，見圖4A。感染 V-ERα-RFP-flag的神經(jīng)細(xì)胞(泳道1)中的ERα蛋白表達(dá)顯著高于感染V-RFP-flag的神經(jīng)細(xì)胞(泳道2)，見圖4B。

Figure 3.RFP expression in V-ERα-RFP-flag-infected neural cells(Scale bar=0.1 mm).A:phase-contrast;B:fluorescence.圖3 V-ERα-RFP-flag感染神經(jīng)細(xì)胞后紅色熒光觀察

Figure 4.Real-time quantitative PCR and Western blotting were used to detect the expression of ERα in V-ERα-RFP-flag-infected neural cells.A:ERα mRNA quantification;B:the expression of ERα protein.Mean±SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs V-RFP-flaginfected neurons.圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting檢測(cè)V-ERα-RPF-flag感染神經(jīng)細(xì)胞中ERα

4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率

與對(duì)照組相比，雌激素組和慢病毒組細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5、表2。

Figure 5.The apoptosis of the cells in control group，estrogen group and lentivirus group.A:control group;B:estrogen group;C:lentivirus group.圖5 對(duì)照組、雌激素組和慢病毒組的細(xì)胞凋亡情況

表2 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和NMDAR1、VGLUT1 mRNA水平Table 2.Apoptotic rate and mRNA expression of NMDAR1 andVGLUT1 in the neural cells(Mean±SD.n=5)

5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光染色檢測(cè)NMDAR1和VGLUT1

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，雌激素組和慢病毒組的NMDAR1和VGLUT1 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。經(jīng)顯微鏡觀察，NMDAR1和VGLUT1主要表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿、胞膜、軸突和樹突，尤其是突觸起始部位，表達(dá)尤為明顯，并且發(fā)現(xiàn)雌激素組和慢病毒組2種蛋白雖也有表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度卻明顯低于對(duì)照組，對(duì)各組圖片的平均IA值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，雌激素組和慢病毒組NMDAR1和VGLUT1的 IA值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖 6、表 3。

Figure 6.The protein expression of NMDAR1 and VGLUT1 detected by immunofluorescence staining(scale bar=0.05 mm).A，B，C:NMDAR1 expression;D，E，F(xiàn):VGLUT1 expression;A，D:control group;B，E:estrogen group;C，F(xiàn):ientivirus group.圖6 免疫熒光染色觀察各組神經(jīng)細(xì)胞NMDAR1和VGLUT1蛋白表達(dá)

表3 各組神經(jīng)細(xì)胞NMDAR1和VGLUT1 IA值Table 3.The IA values of NMDAR1 and VGLUT1 in the neural cells(Mean±SD.n=5)

討 論

Glu廣泛分布于哺乳動(dòng)物CNS，正常狀態(tài)下，神經(jīng)元胞漿的 Glu濃度在10 mmol/L，胞外則為0.6 μmol/L，突觸間隙為1 μmol/L，而在突觸終端囊泡內(nèi)可達(dá)100 mmol/L，當(dāng)突觸間隙內(nèi)Glu過度積聚時(shí)，會(huì)導(dǎo)致Glu受體的過度激活并進(jìn)一步引起興奮性毒性損傷。Glu通過Glu受體被激活后實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)眾多功能，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸的可塑性、學(xué)習(xí)記憶以及突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和長(zhǎng)時(shí)程抑制等。Glu受體分為離子型和促代謝型受體兩大類，代謝型受體屬G蛋白偶聯(lián)受體家族。離子型Glu受體主要包括NMDAR、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑酸受體和紅藻氨酸受體［8］。其中NMDAR是配體門控離子通道，通過不同的NMDAR觸發(fā)不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)誘導(dǎo)神經(jīng)元的死亡［9］。通常認(rèn)為細(xì)胞外液中沒有使Glu失活的水解酶系統(tǒng)，從神經(jīng)末梢釋放出來的Glu，其清除和失活是通過位于突觸前膜和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體的攝取而實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)或功能失調(diào)時(shí)，引起突觸間隙或胞外Glu大量蓄積或者Glu濃度低于正常水平，導(dǎo)致疾病發(fā)生。因此，Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)于興奮性氨基酸的再循環(huán)，興奮性信號(hào)的終止以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞具有特別重要的意義。Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體總體上分為兩大類:VGLUT和質(zhì)膜型Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體，VGLUT有3種亞型，其中VGLUT1和VGLUT2是其主要的亞型，可將胞內(nèi)Glu轉(zhuǎn)運(yùn)入囊泡進(jìn)行隔離，儲(chǔ)存，釋放。

已有研究報(bào)道，雌激素對(duì)CNS起著重要的保護(hù)和調(diào)節(jié)作用［10］，還可影響記憶、學(xué)習(xí)以及認(rèn)知功能。研究發(fā)現(xiàn)雌激素可降低阿爾茨海默病的發(fā)病率［11］，提高腦損傷后的修復(fù)能力，減輕腦損傷后腦細(xì)胞的死亡程度［12］，同時(shí)有研究報(bào)道雌激素對(duì)Glu引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有重要的抵抗和保護(hù)作用［13］，這種保護(hù)作用可能主要是通過抑制NMDAR及受體介導(dǎo)的動(dòng)作電位、調(diào)控L型Ca2+通道、抑制Ca2+內(nèi)流從而減輕Glu毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［14-15］;另一方面雌激素可通過抑制高壓電激活的Ca2+通道從而減少Glu誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。Schreihofer等［16］在研究中發(fā)現(xiàn)雌激素亦可以通過減少Ca2+濃度，從而對(duì)抗Glu興奮毒性，減輕細(xì)胞損傷。Occhiuto等［17］研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可以明顯提高受損細(xì)胞的存活能力，降低皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Glu脫氫酶的釋放量，即可以降低Glu含量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)異黃酮還可以阻止Glu引起的細(xì)胞形態(tài)改變，提示雌激素對(duì)Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。本研究也證實(shí)了雌激素的這種神經(jīng)保護(hù)作用，在本實(shí)驗(yàn)中雌激素組的細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組，說明雌激素可以減少Glu興奮毒性引起的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞生存率，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致。

ERα是雌激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的必要因素，并且已有研究報(bào)道雌激素對(duì)Glu興奮毒性引起細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能通過ERα介導(dǎo)完成。Xia等［3］應(yīng)用ER特異性拮抗劑和選擇性ER調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)ERα在介導(dǎo)雌激素對(duì)抗Glu興奮毒性過程中發(fā)揮了重要作用。Kuo等［18］利用成年雌鼠下丘腦星型膠質(zhì)細(xì)胞，并給予1型Glu代謝性受體、ERα和ERβ不同的調(diào)節(jié)劑后發(fā)現(xiàn)ERα可能介導(dǎo)下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中雌二醇-信號(hào)機(jī)制引起黃體酮合成。在本實(shí)驗(yàn)中，慢病毒組的細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組，提示ERα和雌激素對(duì)Glu興奮毒性引起的細(xì)胞損傷具有相似的保護(hù)作用。

NMDAR1是NMDAR中的主要亞型之一，研究報(bào)道NMDAR1的過度激活是引起Glu興奮毒性損傷的一個(gè)重要原因［19］。質(zhì)膜Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體Glu-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glutamate-aspartate transporter，GLAST)亞型主要位于中樞膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的細(xì)胞膜上，其功能是在病理狀態(tài)下可以快速清除突觸間隙內(nèi)Glu，終止興奮性傳遞。而VGLUTs，尤其是VGLUT1亞型是Glu能神經(jīng)元和它們軸突末端高度特異的標(biāo)志之一，其作用是使Glu在囊泡內(nèi)形成相對(duì)高濃度的聚集，并特異地促進(jìn)Glu釋放進(jìn)突觸間隙，維持Glu的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。不少研究報(bào)道VGLUT1減少，可導(dǎo)致Glu釋放入突觸間隙的量減少并引起多種CNS疾病，如老年癡呆?。?0］、精神分裂癥［21］等;Cheng 等［22］用小鼠模型研究VGLUTs與大腦記憶與學(xué)習(xí)功能關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VGLUTs mRNA后提示VGLUT1 mRNA表達(dá)下調(diào)可引起學(xué)習(xí)和記憶功能的減退，即VGLUT1可提升突觸間Glu傳遞，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞興奮性傳導(dǎo)。同時(shí)有研究報(bào)道在膠質(zhì)細(xì)胞中ERα的激活可以引起GLAST的下調(diào)，減少對(duì)Glu的攝?。?3］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌激素組和慢病毒組VGLUT1和NMDAR1 mRNA表達(dá)量及蛋白IA值均少于對(duì)照組，提示雌激素對(duì)抗Glu興奮毒性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而該作用可能是ERα介導(dǎo)，并通過抑制NMDAR1及VGLUT1完成。

總之，通過本實(shí)驗(yàn)我們觀察到雌激素及ERα重組慢病毒干預(yù)Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，可減輕Glu的興奮性神經(jīng)毒性，而該作用機(jī)制可能是抑制了Glu受體NMDAR1及Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT1完成。但本項(xiàng)研究?jī)H局限于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，需要進(jìn)一步觀察在體實(shí)驗(yàn)中雌激素及ERα對(duì)Glu受體及轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用，分析其作用通路，為其作用機(jī)制提供更多依據(jù)。

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