王勝軍， 薄 寧， 薄其玉， 趙秀鶴， 曹麗麗， 遲兆富

環(huán)孢素(cyclosporin;或環(huán)孢素A，cyclosporin A，CsA)可抑制T細(xì)胞的活化從而抑制免疫系統(tǒng)的活性，被廣泛用于器官移植排斥的治療。環(huán)孢素還可與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的親環(huán)蛋白D結(jié)合，阻斷線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition，MPT)，調(diào)節(jié)線粒體功能及細(xì)胞存亡［1-2］。線粒體是細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，線粒體呼吸鏈復(fù)合物(mi-tochondrial respiratory chain complexes)通過(guò)氧化磷酸化以ATP的形式為細(xì)胞提供能量。大量研究表明，癇性發(fā)作可使線粒體結(jié)構(gòu)受損、能量代謝障礙，而線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常可加重神經(jīng)元損傷，引起神經(jīng)元興奮性增高［3-5］。

癲癇發(fā)作尤其是癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)時(shí)腦組織產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，作用于線粒體，產(chǎn)生毒性作用［6］。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，能反映組織自由基的水平;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是機(jī)體內(nèi)重要的自由基清除酶，對(duì)ROS有清除作用。ROS可造成mPTP開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體功能障礙，因此，抑制ROS產(chǎn)生可有效減輕神經(jīng)元的損傷［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素可減少癲癇中神經(jīng)元損傷并減少癲癇發(fā)作頻率［8］，但環(huán)孢素是否參與調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激及線粒體能量代謝仍未見(jiàn)報(bào)道。本文利用匹魯卡品(pilocarpine)誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)孢素對(duì)癲癇大鼠海馬氧化應(yīng)激和線粒體損傷的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

雄性Wistar大鼠48只，6～8周齡，體重(250±50)g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。環(huán)孢素、匹魯卡品、丙稀酰胺、泛醌、魚(yú)藤酮、抗霉素A、十二烷基麥芽苷、細(xì)胞色素 C和泛醇2購(gòu)自 Sigma。MDA、SOD和ATP試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2 動(dòng)物模型的制作與分組

48只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(control組)、親環(huán)素對(duì)照組(CsA組)、匹魯卡品致癲癇持續(xù)狀態(tài)組(SE組)和環(huán)孢素干預(yù)組(SE+CsA組)，每組12只。SE組大鼠首先皮下注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，用以拮抗匹魯卡品的外周膽堿能反應(yīng)，30 min后腹腔注射匹魯卡品340 mg/kg，觀察大鼠的行為學(xué)變化，達(dá)到Racine 4～5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠被認(rèn)為癲癇模型制作成功，大鼠癲癇發(fā)作持續(xù)1 h后給予腹腔注射地西泮10 mg/kg終止發(fā)作。SE+CsA組大鼠為匹魯卡品注射前30 min腹腔注射環(huán)孢素(10 mg/kg)。CsA組大鼠僅注射環(huán)孢素而不注射匹魯卡品。對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水代替匹魯卡品，各組動(dòng)物分別在腹腔注射24 h后處死。

3 方法

3.1 腦組織樣本制備 大鼠迅速斷頭取腦，分離海馬，冰浴中研磨，600×g離心15 min，取上清液為海馬組織成分。海馬組織加入裂解液，冰浴中充分研磨，800×g離心5 min，取上清液12 000 ×g離心10 min，沉淀為線粒體成分，用保存液懸浮沉淀，采用Bradford法檢測(cè)線粒體蛋白含量。

3.2 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換的檢測(cè) 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換增大時(shí)線粒體膜內(nèi)外滲透失衡，導(dǎo)致吸光度明顯減少。線粒體蛋白加入測(cè)定液(230 mmol/L甘露醇，70 mmol/L蔗糖，3 mmol/L HEPES緩沖液，25℃，pH 7.4)，在540 nm波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。

3.3 MDA和SOD的檢測(cè) 利用MDA可與硫代巴比妥酸縮合，在530 nm處有最大吸收峰，檢測(cè)其活性。利用超氧陰離子自由基與氧化羥胺形成亞硝酸鹽，與顯色劑作用后在550 nm處有最大吸收峰檢測(cè)SOD活性，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3.4 ATP含量的檢測(cè) 利用肌酸激酶催化三磷酸腺苷和肌酸生成磷酸肌酸，用磷鉬酸比色法檢測(cè)海馬組織中ATP含量，實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.5 線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、III活性的檢測(cè) 參照Gao等［5］報(bào)道的方法，將線粒體成分溶于分析介質(zhì)，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測(cè)活性。線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性檢測(cè):溶于介質(zhì)的線粒體反復(fù)凍融3次，加入BSA(2.5 g/L)、抗霉素 A(2 mg/L)、NADH(0.13 mmol/L)、氰化鉀(2 mmol/L)和泛醌(50 μmol/L)，混勻后在340 nm處檢測(cè)吸光度。線粒體呼吸鏈復(fù)合物III活性檢測(cè):溶于分析介質(zhì)的線粒體成分加入細(xì)胞色素 C(15 μmol/L)、魚(yú)藤酮(2 mg/L)、十二烷基麥芽苷(0.6 mmol/L)和泛醇 2(35 μmol/L)，在550 nm處檢測(cè)吸光度的變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 環(huán)孢素可抑制癲癇大鼠海馬組織線粒體通透性轉(zhuǎn)變

SE組大鼠海馬組織的MPT值明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);CsA+SE組大鼠海馬組織的MPT值顯著低于SE組(P＜0.05);CsA對(duì)照組與正常對(duì)照組MPT值之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 環(huán)孢素對(duì)癲癇大鼠海馬組織線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換及呼吸鏈復(fù)合物I、III活性的調(diào)節(jié)Table 1.Effect of cyclosporin A(CsA)on mitochondrial permeability transition(MPT)，mitochondrial respiratory chain complex I and III in rat hippocampus after status epilepticus(SE)(Mean±SD.n=6)

2 環(huán)孢素能減少癲癇大鼠海馬組織的脂質(zhì)過(guò)氧化水平并提高SOD活性

SE組大鼠海馬組織的MDA明顯高于對(duì)照組，SOD明顯低于對(duì)照組(P＜0.05);CsA+SE組大鼠海馬組織的MDA含量顯著低于SE組，SOD活性顯著高于SE組(P＜0.05);CsA對(duì)照組與正常對(duì)照組之間的 MDA含量和 SOD活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表2。

3 環(huán)孢素增加癲癇大鼠海馬組織的ATP含量

SE組大鼠海馬組織的ATP含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);CsA+SE組大鼠海馬組織的ATP含量明顯低于SE組(P＜0.05);CsA對(duì)照組與正常對(duì)照組的ATP含量值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表2。

表2 環(huán)孢素對(duì)癲癇大鼠海馬組織MDA、SOD和ATP水平的調(diào)節(jié)Table 2.Effect of cyclosporin A(CsA)on MDA，SOD and ATP in rat hippocampus after status epilepticus(SE)(Mean±SD.n=6)

4 環(huán)孢素調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性

SE組大鼠海馬組織呼吸鏈復(fù)合物I的活性低于對(duì)照組(P＜0.05);CsA+SE組大鼠海馬組織呼吸鏈復(fù)合物I的活性高于SE組(P＜0.05);CsA對(duì)照組與正常對(duì)照組的呼吸鏈復(fù)合物I活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的呼吸鏈復(fù)合物III活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

討 論

mPTP是一種橫跨于線粒體外膜和內(nèi)膜之間的跨膜多蛋白孔道，其分子組成尚未完全清楚，生理狀態(tài)的mPTP能通過(guò)小于1 500 kD分子量的非特異性物質(zhì)［2，9］。在受到特定刺激后mPTP開(kāi)放，使大分子質(zhì)量物質(zhì)非選擇性地自由通過(guò)線粒體膜，造成線粒體內(nèi)離子平衡紊亂、線粒體腫脹、氧化磷酸化解耦聯(lián)、ATP水平下降，同時(shí)還可引起線粒體膜電位去極化，使細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等凋亡活性物質(zhì)釋放入胞質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。另外，線粒體呼吸功能紊亂，組成線粒體抗氧化防御系統(tǒng)的還原型煙酰胺二核苷酸流失，使線粒體產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)一步加重線粒體的損傷［9］。mPTP開(kāi)放受親環(huán)蛋白D、電壓依賴(lài)性離子通道與腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶的調(diào)節(jié)，環(huán)孢素可通過(guò)結(jié)合親環(huán)蛋白D來(lái)抑制mPTP開(kāi)放，從而引起膜通透性的轉(zhuǎn)變［1，9］。本研究利用分光光度法檢測(cè)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換能力的變化，間接反映mPTP的開(kāi)放情況。本研究結(jié)果表明，匹魯卡品誘發(fā)的大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)可導(dǎo)致海馬線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的大量開(kāi)放，表現(xiàn)為線粒體通透性轉(zhuǎn)變值減小，而環(huán)孢素干預(yù)后可使神經(jīng)元線粒體通透性轉(zhuǎn)變值仍保持較高的水平，提示它可明顯抑制mPTP的開(kāi)放。

癲癇發(fā)作時(shí)產(chǎn)生的大量谷氨酸，可使神經(jīng)元鈣離子濃度增加，順著電化學(xué)梯度進(jìn)入線粒體內(nèi)，導(dǎo)致線粒體內(nèi)鈣超載，從而誘導(dǎo)mPTP開(kāi)放。此外，癲癇造成的氧化應(yīng)激也是調(diào)節(jié)mPTP開(kāi)放的一個(gè)重要因素。雖然腦組織存在多種的抗氧化防御系統(tǒng)，但癲癇發(fā)作時(shí)可產(chǎn)生大量ROS［6］。ROS一方面攻擊神經(jīng)元核DNA，激活核酸修復(fù)酶聚(ADP核糖)聚合酶，加重細(xì)胞能量消耗及激活線粒體凋亡誘導(dǎo)蛋白和炎癥因子［10-11］。另一方面ROS可以通過(guò)氧化mPTP上的硫醇而觸發(fā)mPTP開(kāi)放，損傷線粒體DNA導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合物亞基表達(dá)的改變，影響線粒體的能量代謝［12］。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體抗氧化酶 MnSOD部分缺失可增加腦的興奮性，MnSOD表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)基因小鼠癲癇的發(fā)生率明顯增加，提示線粒體的氧化應(yīng)激可能是癲癇形成的重要機(jī)制［13］。ROS可造成線粒體結(jié)構(gòu)數(shù)目、能量代謝及生物合成異常，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙，促進(jìn)癲癇的形成與反復(fù)發(fā)作［5，7-8］。線粒體既是ROS易損傷的細(xì)胞器，也是ROS產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，ROS可誘導(dǎo)線粒體mPTP開(kāi)放，進(jìn)而加重線粒體腫脹及線粒體呼吸鏈功能，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生［6，9］。本研究顯示，癲癇發(fā)作后海馬組織中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高，同時(shí)自由基清除酶SOD的活性明顯降低，這與以往的報(bào)道一致［7，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素可明顯抑制癲癇發(fā)作造成的海馬組織的氧化損傷，提示減少mPTP開(kāi)放可有效減少癲癇發(fā)作誘發(fā)的ROS增加，阻斷ROS產(chǎn)生與線粒體損傷間的惡性循環(huán)。

線粒體呼吸鏈復(fù)合物位于線粒體內(nèi)膜上，由5個(gè)復(fù)合物組成，分別為NADH氧化還原酶(復(fù)合物I)、琥珀酸氧化還原酶(復(fù)合物II)、細(xì)胞色素還原酶(復(fù)合物III)、細(xì)胞色素C氧化酶(復(fù)合物IV)和ATP合成酶(復(fù)合物 V)［3］。線粒體呼吸鏈復(fù)合物 I、III是線粒體產(chǎn)生ROS的重要部位［3，15］。近些年來(lái)的研究表明，神經(jīng)元線粒體的功能損傷影響神經(jīng)元的生存及可塑性的改變，與癲癇發(fā)生及反復(fù)發(fā)作的維持密切相關(guān)［3，5-7］。本研究發(fā)現(xiàn)，線粒體呼吸鏈復(fù)合物I在癲癇發(fā)作后活性明顯下降，呼吸鏈復(fù)合物III活性無(wú)明顯變化，環(huán)孢素可明顯減輕SE對(duì)神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性的損害。我們以前的研究還發(fā)現(xiàn)，線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV活性在匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇模型急性期表現(xiàn)為代償性增高，而在慢性期則活性下降，而且線粒體基因組參與編碼的復(fù)合物亞基表達(dá)明顯下降，提示線粒體DNA損傷可能是慢性期呼吸鏈復(fù)合物活性降低及慢性癲癇形成的重要原因之一［3，5-6］。線粒體DNA的保護(hù)機(jī)制和修復(fù)機(jī)制均不完善，比核DNA更易受到自由基的攻擊，造成線粒體DNA的降解，使每個(gè)線粒體中DNA的拷貝數(shù)下降，線粒體編碼的呼吸鏈亞單位的合成受損，導(dǎo)致線粒體功能的嚴(yán)重破壞［13］。

總之，環(huán)孢素可減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬氧化應(yīng)激，保護(hù)線粒體呼吸鏈功能。對(duì)此進(jìn)行深入研究有助于我們對(duì)癲癇致神經(jīng)元損傷及癲癇反復(fù)發(fā)作形成機(jī)制的理解。

［1］ Osman MM，Lulic D，Glover L，et al.Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke:its translation from laboratory research to clinical application［J］.Neuropeptides，2011，45(6):359-368.

［2］ Martin LJ.Biology of mitochondria in neurodegenerative diseases［J］.Prog Mol Biol Transl Sci，2012，107:355-415.

［3］ Pieczenik SR，Neustadt J.Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease［J］.Exp Mol Pathol，2007，83(1):84-92.

［4］ Acharya MM，Katyare SS.Structural and functional alterations in mitochondrial membrane in picrotoxin-induced epileptic rat brain［J］.Exp Neurol，2005，192(1):79-88.

［5］ Gao J，Chi ZF，Liu XW，et al.Mitochondrial dysfunction and ultrastructural damage in the hippocampus of pilocarpine-induced epileptic rat［J］.Neurosci Lett，2007，411(2):152-157.

［6］ 劉朝巍，張 濤，楊 卓.氧化應(yīng)激損傷線粒體參與癲癇病理過(guò)程［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(1):198-200.

［7］ Han YX，Lin YT，Xu JJ，et al.Status epilepticus stimulates peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α/mitochondrial antioxidant system pathway by a nitricoxide-dependentmechanism ［J］. Neuroscience，2011，186:128-134.

［8］ Jung S，Yang H，Kim BS，et al.The immunosuppressant cyclosporin A inhibits recurrent seizures in an experimental model of temporal lobe epilepsy［J］.Neurosci Lett，2012，529(2):133-138.

［9］ Elrod JW，Molkentin JD.Physiologic functions of cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition pore［J］.Circ J，2013，77(5):1111-1122.

［10］王勝軍，遲兆富，王樹(shù)華，等.PARP調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬核轉(zhuǎn)錄因子κB及相關(guān)炎癥因子的研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2010，26(1):86-91.

［11］ Chi LY，Wang SJ，Li XG.Poly(ADP-ribose)signal in seizures-induced neuron death［J］.Med Hypotheses，2008，71(2):283-285.

［12］Barros DO，Xavier SM，Barbosa CO，et al.Effects of the vitamin E in catalase activities in hippocampus after status epilepticus induced by pilocarpine in Wistar rats［J］.Neurosci Lett，2007，416(3):227-230.

［13］ Liang LP，Patel M.Mitochondrial oxidative stress and increased seizure susceptibility in Sod2-/+mice［J］.Free Radic Biol Med，2004，36(5):542-554.

［14］曹麗麗，張同霞，王勝軍，等.抗壞血酸對(duì)癲癇大鼠海馬分子伴侶介導(dǎo)的自噬激活的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(6):1140-1143.

［15］ St-Pierre J，Buckingham JA，Roebuck SJ，et al.Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain［J］.J Biol Chem，2002，277(47):44784-44790.