紀 原， 楊碧瑩， 黃小雄， 潘經(jīng)銳， 王鴻軒， 王藝東△

器官缺血再灌注后出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)對組織細胞 損傷起著重要作用。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)家族在各器官缺血再灌注中介導(dǎo)的自身免疫炎癥反應(yīng)近年越來越受到關(guān)注［1］。TLR2、TLR4等在腦缺血再灌注中的作用已有大量研究，但有關(guān)卒中后TLR9表達情況的文獻還較少，其具體細胞表達位點及動態(tài)變化尚未明確。作為族中唯一識別DNA的受體，TLR9不僅辨認細菌/病毒等異源DNA，在一定條件下也能被宿主自身DNA激活［2］。腦缺血再灌注后損傷細胞DNA外溢擴散，很可能激活TLR9及其下游NF-κB及IRF7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過調(diào)控凋亡蛋白等機制［3］影響神經(jīng)結(jié)構(gòu)的損傷和功能的恢復(fù)。本研究擬觀察TLR9在局灶腦缺血再灌注(腦梗死)后的表達情況，明確其主要表達細胞類型，為深入研究TLR9在腦卒中后的作用打下基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動物及主要材料

雄性 SPF級 C57小鼠 30只，體重23～25 g［4］，購自中山大學(xué)東校區(qū)動物中心，置于北校區(qū)動物中心SPF屏障環(huán)境飼養(yǎng)(No.00024488)。環(huán)境維持20～22℃相對恒溫，晝夜時長12 h/12 h，所有籠具、墊料、飼料、飲水均經(jīng)過高溫滅菌，動物自由飲水、進食。線栓購自北京沙東生物技術(shù)有限公司;羊抗TLR9多克?、窨官徸訟bcam;兔抗離子鈣結(jié)合接頭分子 1(ionized calcium-binding adaptor molecule 1，Iba-1)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)和髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)多克?、窨官徸訫illipore;Alexa Fluor 488標記驢抗羊和594標記驢抗兔Ⅱ抗購自Jackson;DAPI購自Roche;4%多聚甲醛、蔗糖(分析純)、OCT冷凍包埋劑、防脫載玻片、Triton X-100、免疫組化筆和防淬滅封片劑購自廣州威佳公司;冷凍切片機和正立式全自動熒光顯微鏡由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心提供;激光多普勒血流儀購自瑞典帕瑞醫(yī)學(xué)(中國)公司。

2 方法

2.1 腦梗死模型制備 全部實驗用鼠隨機分成2組，假手術(shù)組12只，余用于手術(shù)建模。參照Longa線栓法［5］制備小鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，栓塞90 min后將線栓拔出至頸外動脈殘端實現(xiàn)再灌注;假手術(shù)組線栓不進入大腦中動脈。術(shù)中維持肛溫于(37.0±0.5)℃并使用激光多普勒血流儀監(jiān)測，達到如下標準視為缺血再灌注成功:線栓置入大腦中動脈后血流值下降大于75%，拔栓后，血流值上升超過基線值的50%。假手術(shù)組腦血流無變化。動物清醒后出現(xiàn)左上肢內(nèi)收、癱瘓，強迫轉(zhuǎn)圈實驗(+)，自發(fā)轉(zhuǎn)圈追尾，向左側(cè)傾倒，視為模型制備成功。剔除死亡等情況，最終12只入選梗死組。

2.2 取材、制片、定位及細胞計數(shù) 梗死組在再灌注 6 h、3 d、7 d、14 d(假手術(shù)組于相應(yīng)時點)處死取腦，各時點n=3。10%水合氯醛腹腔注射，深度麻醉后迅速開胸。剪破右心耳放血，左心室4℃生理鹽水持續(xù)灌流15 min沖盡血液，續(xù)以20 mL 4%多聚甲醛灌流。開顱取腦，4%多聚甲醛4℃固定過夜，依次浸于10%、20%和30%蔗糖溶液內(nèi)梯度脫水。OCT包埋后切成8 μm冠狀位腦片，載于防脫載玻片上-80℃保存。大體腦片標本早期呈現(xiàn)明顯的水腫、腫脹，后期則萎縮、瘢痕化，肉眼便可以清晰辨別其交界線。鏡檢時，梗死區(qū)可見明顯的核固縮、核碎裂，與周圍相對正常區(qū)差別明顯，用作鏡下初步定位的主要依據(jù)。×5鏡頭先定位至兩者交界處，再逐漸調(diào)至高倍鏡(×5→×10→×20→×40)，準確定位至梗死邊緣區(qū)。沿此線×40鏡下多點隨機拍攝，范圍覆蓋整張腦片的梗死邊緣區(qū)，所得細胞計數(shù)結(jié)果取均值，以保證各切片觀察區(qū)域的一致，及數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

2.3 免疫熒光雙染 TLR9與神經(jīng)元(NeuN)/小膠質(zhì)細胞(Iba-1)/星形膠質(zhì)細胞(GFAP)/少突膠質(zhì)細胞(MBP)共染，步驟如下:1×PBS搖床洗片3次，每次5 min。0.3%Triton X-100室溫孵育30 min。洗片(同前)。10%正常驢血清室溫孵育1 h。輕甩去封閉液后，滴加相應(yīng)Ⅰ抗混合液(TLR9:1∶200;NeuN:1∶300;Iba-1:1∶250;GFAP:1∶200;MBP:1∶400)，4℃濕盒孵育過夜。洗片，滴加相應(yīng)Ⅱ抗混合液(Alexa Fluor 488標記驢抗羊Ⅱ抗1∶800;594標記驢抗兔Ⅱ抗1∶800)，避光室溫孵育1 h。洗片，DAPI避光室溫孵育10 min。洗片，滴加防淬滅劑后蓋玻片封片，熒光下鏡檢。對照片以PBS代替相應(yīng)Ⅰ抗孵育。40倍鏡下觀察梗死組梗死灶邊緣區(qū)，見圖1A，缺血對側(cè)相應(yīng)部位及假手術(shù)組右側(cè)半球。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，以累積吸光度(IA;扣除對照片本底)對TLR9半定量;計數(shù)TLR9陽性的各類細胞并計算陽性率。各樣本腦片均隨機選取后重復(fù)3～4次，所得數(shù)據(jù)取均值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。缺血側(cè)與缺血對側(cè)比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進一步采用LSD法兩兩比較。部分不符合正態(tài)性、方差齊性數(shù)據(jù)采用校正t檢驗或秩和檢驗。用SPSS 20.0軟件包分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腦梗死后TLR9蛋白表達量的變化

Figure 1.Schematic illustration of the evaluated peri-infarct region and the semiquantitative data of integral absorbance(IA)of TLR9.A:observation points(black boxes)between the infarct tissue(dark area)and the normal one(white area)after middle cerebral artery occlusion(MCAO)and reperfusion;B:bar graph of the quantified fluorescent data reveals that IA of TLR9 in the ipsilateral peri-infarct region increased from 6 h to 14 d after MCAO while the contralateral and sham-operated groups showed no significant change.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs sham group.圖1 腦梗死灶邊緣區(qū)取樣示意圖及TLR9熒光半定量結(jié)果

梗死灶邊緣區(qū)代表TLR9的IA值始終高于對側(cè)及假手術(shù)組相同時點的IA值(均P＜0.01)，而且隨時間逐漸增加(均P＜0.01)。相同時點缺血對側(cè)與假手術(shù)組間的IA無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1B。

2 腦梗死后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞TLR9表達變化

2.1 神經(jīng)元變化 梗死灶邊緣區(qū)的神經(jīng)元出現(xiàn)急性缺血缺氧后改變?nèi)绨w縮小變形、核固縮等，部分成為鬼影細胞;缺血對側(cè)與假手術(shù)組的神經(jīng)元形態(tài)無明顯異常。各時點觀察梗死灶邊緣區(qū)、對側(cè)相應(yīng)位置及假手術(shù)組均偶見胞內(nèi)小點狀TLR9著染，主要位于核周胞質(zhì)，見圖2。梗死灶邊緣區(qū)的神經(jīng)元總數(shù)和TLR9陽性神經(jīng)元數(shù)目除6 h外，其余各時點始終低于對側(cè)及假手術(shù)組(均P＜0.01)，兩者均隨時間先降后升(均P＜0.01)，最低值位于7 d，見圖3A。梗死灶邊緣區(qū)各時點TLR9的陽性率以及與其它組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3B。

2.2 小膠質(zhì)細胞變化 梗死灶邊緣區(qū)的小膠質(zhì)細胞胞體增大，突起增多、增粗，呈激活狀態(tài)，胞內(nèi)TLR9著染逐漸增多，由少量小點狀漸變?yōu)閳F塊狀粗顆粒樣;而缺血對側(cè)與假手術(shù)組的小膠質(zhì)細胞呈靜止狀態(tài)，有多條細長分枝狀突起，偶見小點狀TLR9著染，見圖4。梗死灶邊緣區(qū)小膠質(zhì)細胞總數(shù)、TLR9陽性細胞數(shù)和TLR9陽性率始終高于對側(cè)及假手術(shù)組相同時點的相應(yīng)指標(均P＜0.05);組內(nèi)各時點比較，總數(shù)及陽性數(shù)隨時間逐漸增加(均P＜0.01);陽性率隨時間先升后降(均P＜0.05)，于3 d達峰值。缺血對側(cè)小膠質(zhì)細胞僅總數(shù)在后期(7 d、14 d)高于假手術(shù)組(均P＜0.01)，兩組間TLR9陽性細胞數(shù)和TLR9陽性率均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。

2.3 星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的變化 兩者隨時間延長逐漸在梗死灶邊緣區(qū)聚集增生，但始終未見TLR9在胞內(nèi)表達，見圖6。

討 論

TLR9的經(jīng)典配體是非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸序列DNA(CpG-DNA)，主要來源于無脊椎動物如細菌、真菌等病原體［6］;但病理條件下脊椎動物自身DNA釋放外溢，定位于包涵體后也可激活TLR9［7］。靜息情況下TLR9定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)配體進入激活態(tài)細胞溶酶體后，TLR9能在伴侶Unc93b1幫助下迅速募集至內(nèi)吞溶酶體，并以后者為主要表達的細胞器，啟動配體識別和后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［8-9］。本研究中，熒光半定量結(jié)果提示梗死灶周邊組織TLR9表達量較對側(cè)明顯增加，推測梗死灶內(nèi)部壞死組織DNA釋放外溢，但梗死灶周圍膠質(zhì)細胞密集增生形成瘢痕［10］，這些自身DNA碎片主要濃集于周邊組織，成為內(nèi)源性配體激活TLR9。

Figure 2.Immunofluorescence double staining of NeuN(a marker of neuron;red)and TLR9(green).In the contralateral and shamoperated groups，neurons were eumorphism，occasionally with perinuclear tiny dots of TLR9.Remnant neurons in the ipsilateral peri-infarct region exhibited karyopyknosis.Excellular TLR9 staining increased from 6 h to 14 d，but still occasionally with perinuclear tiny dots of TLR9.DAPI labeled cell nucleus.Scale bars=100 μm.圖2 神經(jīng)元和TLR9免疫熒光雙染圖

正常情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞均表達少量 TLR9［11-12］。本實驗中，小鼠在MCAO后，其神經(jīng)元的TLR9陽性率在各時點、組間均無統(tǒng)計學(xué)差異，胞內(nèi)TLR9始終呈散在小點狀著染。這些結(jié)果說明TLR9表達沒有發(fā)生改變。神經(jīng)元無吞噬功能，胞外DNA碎片難以進入，缺乏配體很可能是胞內(nèi)TLR9無反應(yīng)的原因。TLR9陽性神經(jīng)元數(shù)量的變化，由于其趨勢與總數(shù)變化一致，可能是依固有表達比例，隨神經(jīng)元總數(shù)變化的結(jié)果。既往研究發(fā)現(xiàn)，卒中早期由于缺血缺氧及再灌注損傷等原因，神經(jīng)元總數(shù)逐步脫失減少，后期隨著神經(jīng)干細胞的遷移分化可部分恢復(fù)［13］。

Figure 3.Comparison of the total number of neurons，TLR9-positive neuron number(A)and positive rate(B)in each group.Mean±SD.n=3.圖3 各組神經(jīng)元總數(shù)、TLR9陽性神經(jīng)元數(shù)目及陽性率比較

Figure 4.Immunofluorescence double staining of Iba-1(a marker of microglia;red)and TLR9(green).In the contralateral and sham-operated groups，the processes of microglia branched off with further distal arborization，occasionally with tiny dots of TLR9.In ipsilateral peri-infarct region，at 6 h after ischemia and reperfusion(I/R)，the morphological changes of micriglia were not obvious but TLR9 already slightly increased.Microglia showed proliferation，shortened their branches，accompanied with the increase in the intracellular TLR9 at 3 d after I/R.At 7 d and 14 d after I/R，microglia clusters were in activated ameboid state，with intracellular TLR9 staining from scattered tiny dots to clustered coarse particles.DAPI labeled cell nucleus.Scale bars=100 μm.圖4 小膠質(zhì)細胞和TLR9免疫熒光雙染圖

Figure 5.Comparison of the total number of microglia，TLR9-positive microglia number(A)and positive rate(B)in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs sham.圖5 各組小膠質(zhì)細胞總數(shù)、TLR9陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)及陽性率比較

Figure 6.Immunofluorescence merging of GFAP(A;a marker of astrocyte;red)or MBP(B;a marker of oligodendrocyte;red)with TLR9(green).TLR9 was located outside the astrocytes and oligodendrocytes.DAPI labeled cell nucleus.Scale bars=50 μm.圖6 星形膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞與TLR9免疫熒光染色融合圖

我們觀察到，作為 TLR9固有表達的另一細胞——小膠質(zhì)細胞的表現(xiàn)截然不同。缺血側(cè)小膠質(zhì)細胞迅速激活增生，吞噬增加以清除自身壞死物質(zhì)。胞內(nèi)晚期溶酶體中的自身DNA碎片可激活TLR9［8］。本實驗中，梗死灶周圍小膠質(zhì)細胞總數(shù)及TLR9陽性細胞數(shù)均出現(xiàn)升高，TLR9陽性率先升后降，三者始終高于假手術(shù)組，胞內(nèi)TLR9由極少量散在的細粒狀轉(zhuǎn)變?yōu)閳F塊樣深淺不一粗顆粒狀。這些結(jié)果支持小膠質(zhì)細胞的TLR9出現(xiàn)激活上調(diào)。缺血對側(cè)的小膠質(zhì)細胞僅在后期總數(shù)略有增加，可能是因損傷側(cè)神經(jīng)元延伸至對側(cè)的神經(jīng)纖維后期緩慢出現(xiàn)華勒變性所致［14］，但這些纖維在對側(cè)腦組織中所占比例極少，且崩解產(chǎn)物以髓鞘及軸突碎片為主，內(nèi)含自身DNA微乎其微，故本實驗沒有發(fā)現(xiàn)缺血對側(cè)TLR9激活。

本實驗也觀察到，腦梗死后星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞均未見胞內(nèi)TLR9表達。這兩類細胞在梗死灶周邊聚集增生，可能參與了梗死灶周邊膠質(zhì)瘢痕的形成［10］。McKimmie 等［15］在靜息態(tài)原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)TLR9的mRNA表達，給予不同刺激物后觀察到表達量的上/下調(diào)。這一結(jié)果與本實驗及既往其它文獻所見并不一致，推測由于體外特定培養(yǎng)環(huán)境與在體差異所致。

另外，腦梗死后外周諸多炎癥細胞可通過受損的血腦屏障浸潤入腦，但它們大多數(shù)持續(xù)時間短，如中性粒細胞3 d左右即消失［16］;或為目前未發(fā)現(xiàn)TLR9 表達的 CD4+/CD8+/Treg/γδ等 T 細胞［6］。值得注意的是單核-巨噬細胞，其作為抗原呈遞細胞表達TLR9［6］，且能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)駐留較長時間，并與小膠質(zhì)細胞具有相同的起源，目前的細胞標記物還不能將兩者完全區(qū)分開［12，16］。但 Schilling 等［17］利用綠色熒光蛋白標記發(fā)現(xiàn)，相比單核巨噬細胞，中樞定居的小膠質(zhì)細胞在激活時間、數(shù)量及持續(xù)時間方面均占明顯主導(dǎo)地位。由此我們推測，本實驗所見TLR9激活的細胞中，單核巨噬來源極少。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死后腦內(nèi)定居細胞中僅小膠質(zhì)細胞的TLR9選擇性激活。作為腦內(nèi)定居的巨噬細胞，小膠質(zhì)細胞是缺血性卒中后的主要炎癥反應(yīng)細胞，既往研究認為其有雙重作用:早期通過氧自由基及細胞因子等加重神經(jīng)損傷，后期通過吞噬動作及分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子施加修復(fù)作用，但具體機制仍未明確［16］。結(jié)合我們前期發(fā)現(xiàn)腦梗死后TLR9的炎癥損傷通路和細胞保護通路先后被激活［18］，或許是小膠質(zhì)細胞在腦缺血再灌注后能表現(xiàn)出雙重作用的一個重要原因。

［1］ Chang WJ，Toledo-Pereyra LH.Toll-like receptor signaling in liver ischemia and reperfusion［J］.J Invest Surg，2012，25(4):271-277.

［2］ Connolly DJ，O′Neill LA.New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics［J］.Curr Opin Pharmacol，2012，12(4):510-518.

［3］ 郭曉芳，顧 勤，劉 寧，等.P53在急性腎損傷小鼠腎臟的表達及其與細胞凋亡的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2012，28(11):1971-1975.

［4］ 趙 瑾，苑 琳，王馭龍，等.線栓法復(fù)制昆明小鼠局灶性腦缺血再灌注模型的穩(wěn)定性研究［J］.中國病理生理雜志，2011，27(7):1450-1452，1456.

［5］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［6］ Kumagai Y，Takeuchi O，Akira S.TLR9 as a key receptor for the recognition of DNA［J］.Adv Drug Deliv Rev，2008，60(7):795-804.

［7］ Yasuda K，Yu P，Kirschning CJ，et al.Endosomal translocation of vertebrate DNA activates dendritic cells via TLR9-dependent and-independent pathways［J］.J Immunol，2005，174(10):6129-6136.

［8］ Latz E，Schoenemeyer A，Visintin A，et al.TLR9 signals after translocating from the ER to CpG DNA in the lysosome［J］.Nat Immunol，2004，5(2):190-198.

［9］ Fukui R，Saitoh S，Matsumoto F，et al.Unc93B1 biases Toll-like receptor responses to nucleic acid in dendritic cells toward DNA-but against RNA-sensing［J］.J Exp Med，2009，206(6):1339-1350.

［10］ Badan I，Buchhold B，Hamm A，et al.Accelerated glial reactivity to stroke in aged rats correlates with reduced functional recovery［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(7):845-854.

［11］ Kaul D，Habbel P，Derkow K，et al.Expression of Tolllike receptors in the developing brain［J］.PLoS One，2012，7(5):e37767.

［12］Kettenmann H，Hanisch UK，Noda M，et al.Physiology of microglia［J］.Physiol Rev，2011，91(2):461-553.

［13］ Nakatomi H，Kuriu T，Okabe S，et al.Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors［J］.Cell，2002，110(4):429-441.

［14］ Thiel A，Heiss WD.Imaging of microglia activation in stroke［J］.Stroke，2011，42(2):507-512.

［15］ McKimmie CS，F(xiàn)azakerley JK.In response to pathogens，glial cells dynamically and differentially regulate Toll-like receptor gene expression［J］.J Neuroimmunol，2005，169(1-2):116-125.

［16］ Jin R，Yang G，Li G.Inflammatory mechanisms in ischemic stroke:role of inflammatory cells［J］.J Leukoc Biol，2010，87(5):779-789.

［17］ Schilling M，Besselmann M，Muller M，et al.Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia:an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice［J］.Exp Neurol，2005，196(2):290-297.

［18］黃小雄，謝 芬，潘經(jīng)銳，等.TLR9信號通路在大鼠腦梗死灶周圍組織中的雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012，11(5):454-458.