鐘慧霖， 陳文明， 李翠瑩， 王茜婷， 張靜遠(yuǎn)， 蘭 丹， 劉海霞， 鄒清雁△

(1廣州賽吉生物科技有限公司，廣東廣州510633;2廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510510)

中風(fēng)是致殘最大誘因，也是第二大致死性疾?。?-2］，在我國每年中風(fēng)患者有300多萬。傳統(tǒng)治療手段如藥物治療和溶栓治療時間窗短，限制因素多，存在很大的缺陷［3］，因此迫切需要研發(fā)新的治療方法。越來越多的研究提示干細(xì)胞治療有可能為中風(fēng)治療提供一種新的方法［4］。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源廣泛，有高分化潛能，免疫原性弱，并且骨髓MSCs能從骨髓遷移到周邊血管最終進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響神經(jīng)損傷［5］，現(xiàn)有報道的作用機(jī)制包括神經(jīng)元替換、分泌細(xì)胞因子，對神經(jīng)有保護(hù)和營養(yǎng)支持作用以及抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)等［6-8］。

不少學(xué)者用功能基因修飾人MSCs(human MSCs，hMSCs)用于疾病治療并取得了很好的治療效果。早在2005年，Kurozumi等［9-10］使用腺病毒轉(zhuǎn)染方法，將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)或膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)基因轉(zhuǎn)入MSCs進(jìn)行腦室移植治療大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型，取得了較好的治療效果。然而腺病毒在進(jìn)行基因治療實驗中曾經(jīng)有導(dǎo)致患者死亡的報道［11］。

與病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)相比，非病毒載體轉(zhuǎn)染更為安全，有較好的臨床適用性。本研究選擇高效非病毒表達(dá)載體，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將BDNF和GDNF基因轉(zhuǎn)入hMSCs，獲得高表達(dá)的hMSCs，再通過股靜脈注射移植到MCAO大鼠模型體內(nèi)，觀察hMSCs和高表達(dá)BDNF、GDNF的hMSCs聯(lián)合移植對MCAO的影響，旨在探索非病毒載體轉(zhuǎn)染hMSCs的效率及其對MCAO的影響，為腦血管病治療臨床研究提供一種干細(xì)胞相關(guān)的基因治療方法。

材料和方法

1 動物、細(xì)胞和載體

SPF級Wistar大鼠30只(最終納入實驗)，體重270～300 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0015。hMSCs由廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)醫(yī)學(xué)研究中心提供。質(zhì)粒pEGFPN2、pCAG-Kan-Neo、pCMV-Neo 和大腸桿菌菌株TOP10由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈。

2 主要試劑

基因組 DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DNA回收試劑盒(北京天根生化科技公司);DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶(TaKaRa);胎牛血清和α-MEM(HyClone);L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必須氨基酸、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、DMSO、Lipofectamine? 2000 transfection reagent和0.05%胰蛋白酶(Invitrogen);G418(Merk);維生素C(vitamin C，Vit C)(Sigma);BDNF和GDNF ELISA試劑盒(RD System)。所用引物由華大基因設(shè)計合成。

3 主要方法

3.1 hMSCs的分離培養(yǎng) 從健康成人志愿者體內(nèi)采集骨髓血，采用我們自行研發(fā)的專利分離液分離單個核細(xì)胞，加自配改良細(xì)胞培養(yǎng)基(89% α-MEM、10%FBS、1%GlutaMAX、0.1% β-巰基乙醇、50 mg/L Vit C、5 ng/L血小板源性生長因子)進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，傳至第3代做流式細(xì)胞術(shù)鑒定。經(jīng)鑒定MSCs純度較高的用于后續(xù)基因提取以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

3.2 載體構(gòu)建 從原代hMSCs中提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA(方法參照試劑盒說明書)。設(shè)計GDNF引物正義鏈 5′-ATGCAGTCTTTGCCTAACAGCAATG-3′，反 義 鏈 5′-TCAGATACATCCACACCTTTTAGCG-3′;BDNF 引 物 正 義 鏈 5′-ATGACCATCCTTTTCCTTACTAT-3′，反義鏈 5′-CTATCTTCCCCTTTTAATGGTC-3′。以此 cDNA為模板進(jìn)行 PCR克隆BDNF和GDNF并送公司測序與NCBI上序列進(jìn)行比對(GDNF:AY052832;BDNF:EF674517)，經(jīng)測序證實序列與GenBank上一致。在BDNF和GDNF基因片段兩端加上合適的酶切位點分別連接到pCAGKan-Neo和 pCMV-Neo上。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌擴(kuò)增，提質(zhì)粒酶切鑒定并送公司測序，比對測序結(jié)果，將測序正確無突變克隆的用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

3.3 質(zhì)粒擴(kuò)增、線性化 將質(zhì)粒pCAG-BDNF、pCMV-GDNF或pEGFP-N2轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌，擴(kuò)增后進(jìn)行質(zhì)粒提取，用ApaL I進(jìn)行酶切線性化，經(jīng)電泳鑒定確認(rèn)線性化完全后乙醇沉淀，用無菌水溶解。保證終總量在24 μg以上。

3.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞 復(fù)蘇細(xì)胞于10 cm培養(yǎng)皿，長滿后以1∶3傳代至新10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后分別進(jìn)行pCAG-BDNF、pCMV-GDNF和pEGFP-N2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(方法依照試劑盒說明書)，轉(zhuǎn)染后4～6 h換液，24 h取上清進(jìn)行ELISA檢測并以1∶3傳代。在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。48 h后加G418(300 mg/L)進(jìn)行篩選。每2 d換液1次，大約10～15 d長出克隆，然后將克隆細(xì)胞傳代擴(kuò)增，凍存。將ELISA檢測中BDNF和GDNF蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞用于動物實驗。

3.5 動物行為訓(xùn)練 對所有大鼠(體重約260 g)進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練:(1)貼附物移除實驗，將圓形標(biāo)簽紙(直徑16 mm)貼到大鼠兩前爪，放回籠子，記錄其撕紙時間，大于1 min按1 min計算。每天3次中間間隔10 min以上。(2)轉(zhuǎn)棒實驗，將大鼠放到疲勞儀轉(zhuǎn)棒上，設(shè)定疲勞儀轉(zhuǎn)動時間3 min，20 r/min訓(xùn)練2次，25 r/min訓(xùn)練2次，30 r/min訓(xùn)練5次。每天訓(xùn)練3次，間隔10 min以上。

3.6 制作MCAO模型 將訓(xùn)練合格的大鼠(12 s內(nèi)移除貼附物，轉(zhuǎn)棒儀跑步測序持續(xù)170 s以上)制作MCAO模型，方法參照 Kurozumi等［10］的制作方法。24 h后對模型鼠進(jìn)行功能評分，參照Longa評分并進(jìn)行改良，具體如下:0分:無神經(jīng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:提尾對側(cè)肩內(nèi)收，身體綣起;3分:提尾放地上向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或輕微自發(fā)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;4分:向?qū)?cè)傾倒;5分:意識喪失，不能自發(fā)行動。選取評分為2～3分的大鼠18只隨機(jī)分成3組，每組6只，分別為PBS對照組、hMSCs治療組和轉(zhuǎn)基因hMSCs治療組。另制作假手術(shù)大鼠6只。

3.7 細(xì)胞移植前準(zhǔn)備 復(fù)蘇待移植細(xì)胞，培養(yǎng)傳代至細(xì)胞足量。移植前用0.05%胰酶消化細(xì)胞，收集到離心管，離心，棄上清，加10 mL PBS重懸后離心重復(fù)3次以徹底洗去血清，用血小板計數(shù)器計數(shù)。加適量PBS重懸使細(xì)胞密度為1.5×109/L。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入無菌EP管中，密封，置冰上，待移植。

3.8 MCAO后24 h股靜脈移植細(xì)胞 麻醉大鼠，固定，從股靜脈進(jìn)針移植細(xì)胞，速度控制在1 mL/5 min左右(其中假手術(shù)組和PBS對照組移植1 mL PBS;hMSCs治療組移植1 mL hMSCs;轉(zhuǎn)基因治療組移植0.5 mL BDNF-hMSCs和0.5 mL GDNF-hMSCs細(xì)胞混合液;另移植EGFP-hMSCs 1 mL于3只正常大鼠和3只MCAO模型鼠。所有細(xì)胞密度都是1.5×109/L)。

3.9 體重變化及行為評估 從手術(shù)造模開始每天稱量大鼠體重。手術(shù)后3、5、7、10和14 d進(jìn)行行為學(xué)測試。方法同訓(xùn)練，貼附物移除實驗計時改為5 min，大于5 min按5 min計算，每天2次，中間間隔10 min以上;轉(zhuǎn)棒儀實驗參數(shù)設(shè)定為25 r/min 3 min，每天2次，間隔10 min以上。

3.10 灌注取腦觀察 2周后深度麻醉大鼠，打開胸腔腹腔充分暴露心臟，用注射器經(jīng)心尖通過左心室插入主動脈，剪開右心耳后灌注生理鹽水250 mL左右至右心耳流出透明液體。換4%多聚甲醛液繼續(xù)灌注，出現(xiàn)肌顫后緩慢灌注至肝臟的顏色變白變硬，約灌注250mL。取出大腦，置4%多聚甲醛中固定1 d后觀察梗死區(qū)域并拍照。

3.11 HE染色觀察及腦梗死體積計算 將所有實驗組大鼠腦組織于4%多聚甲醛中固定1 d后將腦組織切成2 mm厚的5個冠狀切片(從松果體腺往嗅球方向每隔2 mm切1片)。將切片于4%多聚甲醛中固定2 d，做常規(guī)石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察，拍照。用圖像處理軟件處理圖像，測量切片梗死區(qū)域面積，計算腦梗死相對體積，參照 Neumann-Haefelin等的腦相對梗死體積百分比計算公式:各切片梗死面積=對側(cè)面積-梗死側(cè)非梗死區(qū)域面積;各切片梗死體積=切片兩面梗死面積之和×切片厚度/2;相對梗死體積百分比=各切片梗死體積之和/大腦體積。

3.12 振動切片觀察細(xì)胞遷移 取移植了EGFP-hMSCs大鼠的腦組織于4%多聚甲醛中固定1 d后將腦組織切成2 mm厚的5個冠狀切片(方法如前所述)。配4%瓊脂糖包埋各切片，于振動切片儀上進(jìn)行切片，50 μm/片，然后將切片置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞的分離與體外擴(kuò)增

采用我們自行研發(fā)的專利分離液分離hMSCs，體外培養(yǎng)使用培養(yǎng)基在傳統(tǒng)hMSCs培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加血小板源性生長因子、β-巰基乙醇和Vit C。此改良培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞增殖較快，且傳代至第16代以上仍未見有細(xì)胞老化和分化跡象，優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基，見圖1。取培養(yǎng)后的細(xì)胞做流式細(xì)胞術(shù)鑒定，結(jié)果表明培養(yǎng)第3代的hMSCs已經(jīng)有了較高的純度，見圖2。

Figure 1.Effects of our self-made medium and traditional medium on hMSCs culture(×40).A:traditional medium;B:our self-made medium.圖1 自配改良培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)hMSCs的效果比較

Figure 2.Flow cytometry analysis of the hMSCs(passage 3).圖2 第3代hMSCs的流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果

2 細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染修飾

將載體 pCAG-BDNF、pCMV-GDNF和 pEGFP-N2分別用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至hMSCs。轉(zhuǎn)染效率在70%左右，見圖3。通過ELISA檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清液中的BDNF和GDNF表達(dá)量，結(jié)果非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)pEGFP-N2細(xì)胞表達(dá)量較少，轉(zhuǎn)入pCMV-GDNF和pCAG-BDNF細(xì)胞2種營養(yǎng)因子表達(dá)量遠(yuǎn)大于非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)入載體pEGFP-N2的細(xì)胞，見表1。

Figure 3. The cell transfection rate 24 h after transfection(×40).圖3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率

表1 基因轉(zhuǎn)染對hMSCs BDNF和GDNF表達(dá)的影響Table 1.Effect of gene transfection on the expression of BDNF and GDNF in hMSCs(ng/L.Mean±SD.n=3)

3 細(xì)胞移植前后各組動物體重的變化

從大鼠體重下降到最低的時間和2周后動物體重恢復(fù)比例對其體重變化進(jìn)行分析，結(jié)果轉(zhuǎn)基因組體重開始恢復(fù)的時間與PBS組相比顯著提前(P＜0.05)，平均開始恢復(fù)時間早于hMSCs組，體重在第14天能夠恢復(fù)到原體重的90%左右，顯著高于PBS對照組(P＜0.05)，平均體重恢復(fù)高于hMSCs組;hMSCs組平均體重開始恢復(fù)時間比PBS組早，14 d后平均體重恢復(fù)高于PBS組，但由于其組內(nèi)差異比較大，hMSCs組體重變化與PBS組以及轉(zhuǎn)基因組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖4。

4 細(xì)胞移植前后各組動物行為學(xué)變化及腦梗死體積的比較

4.1 左腿貼附物移除時間 在第3天兩治療組貼附物移除時間要顯著短于PBS對照組(P＜0.05)，第5天后差異不顯著(P＞0.05)，說明干細(xì)胞能促進(jìn)腦損傷大鼠較早期的身體機(jī)能恢復(fù)，見圖5。

4.2 右腿貼附物移除時間 轉(zhuǎn)基因組在第7天開始其右腿貼附物移除要顯著快于PBS對照組(P＜0.05)，平均時間比hMSCs組短;hMSCs組與PBS組相比在第14天有顯著改善(P＜0.05)，在其它時點平均時間比PBS組短;PBS組大鼠的貼附物移除時間2周內(nèi)與假手術(shù)組相比明顯延長(P＜0.05)，而兩治療組從第5天開始貼附移除時間接近于假手術(shù)組(P ＞0.05)，見圖5。

Figure 4.The changes of the body weight of the rats with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs PBS.圖4 各組大鼠體重的變化

Figure 5.Behavioral test and infarction volume analysis.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs PBS.圖5 行為學(xué)評估和腦梗死體積分析

4.3 轉(zhuǎn)棒儀跑步持續(xù)時間 從第10天開始轉(zhuǎn)基因組跑步能力顯著高于PBS組(P＜0.05)，其平均水平在所有時點均高于hMSCs組;hMSCs組平均跑步能力在所有時點均高于PBS組;PBS組與假手術(shù)組相比跑步能力一直未有顯著恢復(fù)(P＜0.05)，從第7天開始兩治療組與假手術(shù)組跑步差異不顯著(P＞0.05);hMSCs組組內(nèi)差異比較大，其與PBS組以及轉(zhuǎn)基因組無顯著差異，見圖5。

4.4 腦梗死體積百分比 轉(zhuǎn)基因治療組腦梗死體積占總腦體積百分比(11.16% ±2.21%)比PBS組(15.42% ±1.34%)顯著縮小(P＜0.05)，平均值小于hMSCs組(13.95% ±3.21%);hMSCs治療組腦梗死體積平均值小于PBS組;hMSCs治療組組內(nèi)差異較大，與PBS組以及轉(zhuǎn)基因組相比均無顯著差異，見圖5。

5 腦組織外觀及HE染色

5.1 腦外觀 (1)假手術(shù)組腦組織表面光滑完整;(2)PBS組腦組織表面粗糙，有一定程度的萎縮和較大面積的梗死區(qū)域;(3)轉(zhuǎn)基因治療組腦組織較為光滑，萎縮程度和梗死區(qū)域明顯減小;(4)hMSCs治療組治療效果組內(nèi)差異較大，部分治療大鼠腦組織如轉(zhuǎn)基因治療組(4例)表現(xiàn)為梗死區(qū)域減小，部分治療大鼠腦組織(2例)與PBS組類似差異不明顯，見圖6。

5.2 HE染色 (1)假手術(shù)組腦組織細(xì)胞間緊密相連無梗死區(qū)域;(2)PBS組有較大面積梗死區(qū)域，梗死區(qū)域細(xì)胞稀疏排布;(3)轉(zhuǎn)基因組梗死區(qū)域面積較hMSCs組和PBS組小，梗死區(qū)細(xì)胞排布稀疏程度低;(4)hMSCs組有4例梗死區(qū)域比PBS組小，梗死區(qū)域細(xì)胞密度比PBS組大，也有2例其結(jié)果與PBS對照組相似，見圖6。

Figure 6.Infarct region obsrvation.In sham group，the surface of the rat brain was glossy and the cells of the brain were compact.In PBS group，the brain of the rats was rough and shriveled，and some interspaces between the cells in the infarct zone were observed.In hMSCs group，the rat brain also shriveled and there were some interspaces between the cells in the infarct area，but smaller than those in PBS group.In modified hMSCs group，the brain shriveled，infarct area was not significant，and the interspaces between the cells in the infarct area were the smallest in MCAO groups.圖6 腦梗死區(qū)域觀察

6 細(xì)胞遷移

通過GFP示蹤，我們在健康大鼠腦部和中風(fēng)模型大鼠腦組織未梗死區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)熒光細(xì)胞，僅在極少數(shù)切片的腦梗死區(qū)域發(fā)現(xiàn)少量綠色熒光細(xì)胞，見圖7。

討 論

Figure 7.Migration of the hMSCs.A:sham;B:PBS;C:hMSCs;D:modified hMSCs.At day 14 after hMSCs were injected to the MCAO rats through the femoral vein，the hMSCs migrated to the infarcted hemisphere.A few exogenous cells only survived in the infarct area of the brain in the MCAO rats and they had no differentiation.圖7 hMSCs在大鼠腦部的遷移

已有研究報道hMSCs腦室移植治療MCAO模型大鼠取得了良好的效果［12］。一些學(xué)者研究認(rèn)為hM SCs移植治療MCAO模型大鼠效果與對照組相比無顯著差異，而用腺病毒介導(dǎo)BDNF或GDNF基因修飾的hMSCs移植治療MCAO模型大鼠有良好的效果［9-10］。然而其研究使用腺病毒載體，具有較大的臨床風(fēng)險。本研究選擇非病毒高效表達(dá)載體并進(jìn)行優(yōu)化，用脂質(zhì)體法介導(dǎo)基因修飾，與病毒載體相比更安全，有較好的臨床應(yīng)用前景。

BDNF和GDNF是極為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，它們能夠為感覺神經(jīng)元、運動神經(jīng)元以及多巴胺神經(jīng)元提供強(qiáng)大的營養(yǎng)支持作用，減少神經(jīng)元凋亡并在神經(jīng)元修復(fù)和結(jié)構(gòu)重建過程中起重要作用［13］。目前研究表明當(dāng)腦缺血后BDNF和GDNF的表達(dá)會受到影響［14］。本研究原擬進(jìn)行雙基因修飾hMSCs，然而在實際中發(fā)現(xiàn)，雙基因修飾存在一定缺陷:雙基因修飾細(xì)胞并非能同時高表達(dá)兩種蛋白，其中一種蛋白表達(dá)會受到明顯抑制。因此本研究分別用單基因修飾干細(xì)胞，然后將二種干細(xì)胞混合用于移植治療。

本研究首次用脂質(zhì)體介導(dǎo)BDNF基因修飾的hMSCs和GDNF基因修飾的hMSCs聯(lián)合股靜脈移植治療MCAO模型大鼠，跟PBS對照組相比，能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)并且能有效減小腦梗死體積。而hMSCs治療組間差異大，效果不穩(wěn)定，但綜合水平優(yōu)于PBS組。這說明細(xì)胞轉(zhuǎn)入BDNF基因和GDNF基因能夠?qū)δX中風(fēng)模型有更有效、更穩(wěn)定的治療效果。

我們采用綠色熒光蛋白示蹤，觀察靜脈移植的hMSCs，15 d后在大鼠腦組織中的存活以及遷移情況，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)的細(xì)胞在中風(fēng)大鼠腦梗死區(qū)域中存活，未見分化現(xiàn)象。這說明在MSC靜脈移植治療中，神經(jīng)元替換作用有限。BDNF和GDNF 2種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子可加強(qiáng)了hMSCs的作用，說明營養(yǎng)因子在對抗神經(jīng)損傷和在損傷后修復(fù)中起著重要作用。有研究報道，通過靜脈移植hMSCs至MCAO模型大鼠體內(nèi)，第2天能夠在腦損傷區(qū)域檢測到較多的存活hMSCs，隨著時間的推移，細(xì)胞逐漸減少［15］。由此可見，細(xì)胞治療腦缺血病的作用機(jī)制可能是遷移到腦損傷區(qū)域，分泌多種營養(yǎng)因子對抗神經(jīng)損傷和促進(jìn)修復(fù)，而細(xì)胞本身受到機(jī)體免疫等相關(guān)機(jī)制的調(diào)節(jié)而逐漸死亡消失。

本研究首次用脂質(zhì)體介導(dǎo)非病毒的BDNF基因修飾的hMSCs和GDNF基因修飾的hMSCs，通過股靜脈移植治療MCAO模型大鼠，與hMSCs相比有更好的治療效果。我國干細(xì)胞臨床研究管理辦法即將出臺，本研究中所使用的非病毒載體、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法以及靜脈移植均具有較大的臨床適用性，能夠為干細(xì)胞相關(guān)的基因治療腦血管病研究提供參考。

(致 謝:感謝中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)研究組各成員的指導(dǎo)和幫助!)

［1］ Lopez AD，Mathers CD，Ezzati M，et al.Global and regional burden of disease and risk factors，2001:systematic analysis of population health data［J］.Lancet，2006，367(9524):1747-1757.

［2］ Kolominsky-Rabas PL，Heuschmann PU，Marschall D，et al.Lifetime cost of ischemic stroke in Germany:results and national projections from a population-based stroke registry:the Erlangen Stroke Project［J］.Stroke，2006，37(5):1179-1183.

［3］ Sahota P，Savitz SI.Investigational therapies for ischemic stroke:neuroprotection and neurorecovery［J］.Neurotherapeutics，2011，8(3):434-451.

［4］ Wechsleer L，Steindler D，Borlongan C，et al.Stem cell therapies as an emerging paradigm in stroke(STEPS):bridging basic and clinical science for cellular and neurogenic factor therapy in treating stroke［J］.Stroke，2009，40(2):510-515.

［5］ Borlongan CV，Glover LE，Tajiri N，et al.The great migration of bone marrow-derived stem cells toward the ischemic brain:therapeutic implications for stroke and other neurological disorders ［J］.Prog Neurobiol，2011，95(2):213-228.

［6］ Mine Y，Tatarishvili J，Oki K，et al.Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Neurobiol Dis，2013，52:193-201.

［7］ Abdi R，F(xiàn)iorina P，Adra CN，et al.Immunomodulation by mesenchymal stem cells:a potential therapeutic strategy for type 1 diabetes［J］.Diabetes，2008，57(7):1759-1767.

［8］ Kitada M，Dezawa M.Induction system of neural and muscle lineage cells from bone marrow stromal cells;a new strategy for tissue reconstruction in degenerative diseases［J］.Histol Histopathol，2009，24(5):631-642.

［9］ Kurozumi K，Nakamura K，Tamiya T，et al.BDNF genemodified mesenchymal stem cells promote functional recovery and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model［J］.Mol Ther，2004，9(2):189-197.

［10］ Kurozumi K，Nakamura K，Tamiya T，et al.Mesenchymal stem cells that produce neurotrophic factors reduce ischemic damage in the rat middle cerebral artery occlusion model［J］.Mol Ther，2005，11(1):96-104.

［11］ Helledie T，Nurcombe V，Cool SM.A simple and reliable electroporation method for human bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Stem Cell Dev，2008，17(4):837-848。

［12］ Chen J，Li Y，Katakowski M，et al.Intravenous bone marrow stromal cell therapy reduces apoptosis and promotes endogenous cell proliferation after stroke in female rat［J］.J Neurosci Res，2003，73(6):778-786.

［13］ Crigler L，Robey RC，Asawachaicharn A，et al.Human mesenchymal stem cell subpopulations express avariety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis ［J］.Exp Neurol，2006，198(1):54-64.

［14］Arvidsson A，Collin T，Kirik D，et al.Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke［J］.Nat Med，2002，8(9):963-970.

［15］ Liu YP，Seckin H，Izci Y，et al.Neuroprotective effects of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells in transient focal cerebral ischemia in rats［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2009，29(4):780-791.