丁 浩， 張吉翔

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西南昌330006)

人鼠雙微體2(murine double minute 2，Mdm2)和鼠雙微體4(murine double minute 4，Mdm4)是屬于同一家族且進(jìn)化保守的原癌蛋白，在序列上與小鼠有著較高的同源性。兩者在一級(jí)結(jié)構(gòu)上具有同源性，特別是在P53蛋白結(jié)合域更是如此，因此Mdm2和Mdm4均能與P53蛋白相結(jié)合;并且，Mdm2羧基末端的金屬結(jié)合域在Mdm4分子中亦是高度保守的［1］。Mdm2能使得P53的抑癌活性喪失，抑制其抗腫瘤活性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成［2］。人剪切修復(fù)基因著色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D，XPD)是轉(zhuǎn)錄因子ⅡH(transcription factorⅡH，TFⅡH)的一個(gè)組分［3］。大量研究發(fā)現(xiàn)，XPD除了在TFⅡH介導(dǎo)的核苷酸切除修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮主要作用外，還參與了細(xì)胞的增殖和凋亡，并能起到抑癌基因的作用［4-5］。因此我們假設(shè)XPD能下調(diào)Mdm2和Mdm4的表達(dá)。為此，本研究用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染進(jìn)入人肝癌細(xì)胞株以使得XPD高表達(dá)，然后檢測(cè)Mdm2、Mdm4和P53表達(dá)量的變化，并觀察肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

材料和方法

1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection，ATCC);培養(yǎng)基DMEM購自HyClone;胎牛血清購自Gibco;重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空載質(zhì)粒pEGFP-N2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，pEGFP-N2/XPD已通過PCR反應(yīng)、酶切及基因測(cè)序三重鑒定［6］。LipofectamineTM2000和Trizol購自Invitrogen;MTT購自Solarbio;DMSO購自Amresco;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Fermentas;引物由Generay Biotech合成;2×Taq PCR MasterMix購自天根生物技術(shù)有限公司;總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;Ⅰ抗XPD、Mdm2、Mdm4、P53和β-actin購自Santa Cruz;Ⅱ抗辣根過氧化物酶IgG購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清和雙抗(1×105U/L的青霉素和100 mg/L的鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和空氣濕度和5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以1×105cells/well的密度將細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，24 h后細(xì)胞融合率約為90%。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空載質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒每孔4.0 μg，脂質(zhì)體每孔10 μL介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、pEGFP-N2組和pEGFP-N2/XPD組。轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞。

2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將細(xì)胞種植在96孔板中，空白調(diào)零孔只加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入 150 μL DMSO，振蕩 15 min，酶標(biāo)儀(Labsystems)測(cè)定492 nm處各孔吸光度(A)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率 用胰酶消化收集上述各組細(xì)胞，采用碘化丙啶(propidium iodide，PI)單染法，應(yīng)用 FACSCalibar流式細(xì)胞儀(Beckton Dickinson)分析細(xì)胞周期，得出細(xì)胞各周期的百分率。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率按試劑說明書進(jìn)行，主要步驟為:用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，再用500 μL的 binding buffer懸浮細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC和 PI各5 μL，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞總RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄參照試劑說明書進(jìn)行操作。XPD上游引物為 5′-TCTGCCTCTGCCCTATGAT-3′，下游引物為5′-CGATTCCCTCGGACACTTT-3′，產(chǎn) 物 大 小 為 363 bp;Mdm2上游引物為 5′-ACCGAGTCTTGCTCTGTTAC-3′，下 游 引 物 為 5′-GGTGTGGTGGCAGATGAC-3′，產(chǎn)物大小為 139 bp;Mdm4 上游引物為 5′-GATGATACCGATGTAGAGG-3′，下游引物 5′-TCAGAACTGTGAGCCAAA-3′，產(chǎn)物大小為332 bp;P53上游引物為 5′-CTACAAGCAGTCACAGCACATGAC-3′，下游引物為 5’-TCATTCAGCTCTCGGAACATCTCG-3′，產(chǎn)物大小為 551 bp;β-actin上游引物為 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游 引物 為 5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，產(chǎn)物大小為 434 bp。PCR 反應(yīng)體系如下:cDNA 500 ng，上、下游引物各 1 μL，2 ×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，補(bǔ)去離子水至終體積25 μL。按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增:預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)，94℃ 5 min;PCR反應(yīng)，94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 55 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。取 5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用暗箱式紫外透射儀觀察電泳結(jié)果并拍照。結(jié)果用Band Leader 3.0軟件，以目的條帶/β-actin的吸光度比值進(jìn)行分析。

2.5 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 用RIPA法取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取100 μg進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白。蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉溶液4℃封閉過夜。膜分別用按相應(yīng)比例稀釋的 XPD、Mdm2、Mdm4和 β-actin的Ⅰ抗孵育，4℃過夜，Ⅱ抗孵育2 h，DAB顯色照相。結(jié)果用Quantity One 4.62軟件，以目的條帶/β-actin的灰度比值進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活力的影響

MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的A值明顯低于空白對(duì)照組和空載質(zhì)粒pEGFPN2組(P＜0.01);而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表 1。

表1 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期及凋亡率的變化Table 1.The changes of viability，cell cycle and apoptotic rate of HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD(Mean±SD.n=6)

2 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的G1期細(xì)胞明顯增多(P＜0.01)，S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.01);而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間相比，G1期細(xì)胞和S期細(xì)胞差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1、表1。

Figure 1.The change of cell cycle of HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD.圖1 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞周期的變化

3 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒 pEGFP-N2/XPD組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組和空載質(zhì)粒pEGFP-N2組(P＜0.01);而空白對(duì)照組與空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2、表1。

Figure 2.The change of apoptotic rate of HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD.圖2 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞凋亡率的變化

4 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞的 XPD、Mdm2、Mdm4和P53 mRNA表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染明顯增加了XPD mRNA的表達(dá)(P＜0.01);與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的Mdm2和Mdm4 mRNA的表達(dá)明顯減少，P53 mRNA的表達(dá)明顯增多(均 P＜0.01);而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3。

Figure 3.The changes of XPD，Mdm2，Mdm4 and P53 mRNA expression in HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD.M:100 bp marker;A:blank control group;B:pEGFP-N2 group;C:pEGFP-N2/XPD group.Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs pEGFP-N2 group or blank control group.圖3pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的XPD、Mdm2、Mdm4和P53 mRNA表達(dá)水平的變化

5 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞的 XPD、Mdm2、Mdm4和P53蛋白表達(dá)水平的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染明顯增加了XPD蛋白的表達(dá)(P＜0.01);與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的Mdm2和Mdm4蛋白的表達(dá)明顯減少(均P＜0.01)，P53蛋白的表達(dá)明顯增多(P＜0.05);而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFPN2組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖4。

Figure 4.The changes of XPD，Mdm2，Mdm4 and P53 protein expression in HepG2 cells treated with pEGFP-N2/XPD.A:blank control group;B:pEGFP-N2 group;C:pEGFP-N2/XPD group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs pEGFP-N2 group or blank control group.圖4pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的XPD、Mdm2、Mdm4和P53蛋白表達(dá)水平的變化

討 論

Mdm2和Mdm4參與細(xì)胞調(diào)控的多條通路，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)，很多人類腫瘤中都存在著Mdm2和Mdm4過度表達(dá)的現(xiàn)象［7］。在腫瘤細(xì)胞中，Mdm2和Mdm4的過表達(dá)，使得野生型P53(wt-P53)的抑癌活性喪失，抑制其抗腫瘤活性，促進(jìn)腫瘤的形成。因此，Mdm2和Mdm4 是 wt-P53 的負(fù)調(diào)節(jié)因子［8］。Riedinger等［9］發(fā)現(xiàn)，通過抑制Mdm2和Mdm4以恢復(fù)P53的活性，可起到抑制腫瘤的作用［9］。在體外的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過基因敲除使得Mdm2和Mdm4缺失，這能誘導(dǎo)P53依賴的凋亡。而Mdm2和Mdm4異二聚體的形成對(duì)抑制P53活性起到了至關(guān)重要的作用［10］。本研究組既往的研究亦發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾技術(shù)使Mdm2表達(dá)下調(diào)，這抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡;同時(shí)，沉默Mdm2的表達(dá)能上調(diào)p21的表達(dá)，而后者是P53通路最重要的下游基因之一［11］。當(dāng)然，Mdm2和Mdm4亦可通過非P53依賴的方式誘導(dǎo)腫瘤形成［12］。在抑制 P53方面，Mdm2和 Mdm4承擔(dān)著不同卻又互補(bǔ)的作用:Mdm2主要調(diào)節(jié)P53的穩(wěn)定性，而 Mdm4 調(diào)節(jié) P53 的活性［13］。

TFⅡH 是由 9 個(gè)亞基(XPB、XPD、P62、P52、P44、P34、cdk7、cyclinHT 和 MATl)組成的多酶復(fù)合物，XPD作為其支架，介導(dǎo)著復(fù)合物內(nèi)部的連接［14］。XPD基因的突變與3種人類遺傳性疾病有關(guān)，即著色性干皮病、Cockayne綜合癥和毛發(fā)硫性營(yíng)養(yǎng)不良［15］。XPD具有單鏈DNA解旋酶活性，參與了核酸剪切修復(fù)，它的功能缺陷可導(dǎo)致突變的基因得不到有效的修復(fù)，同時(shí)也會(huì)影響一些癌基因和抑癌基因的功能，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生［16］。

如上所述，XPD能起到抑癌基因的作用，而Mdm2和Mdm4可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。因此，我們可以假設(shè):XPD能下調(diào)Mdm2和Mdm4的表達(dá)。為此，本研究用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染進(jìn)入人肝癌細(xì)胞株以使得XPD高表達(dá)，然后檢測(cè)Mdm2、Mdm4和P53表達(dá)量的變化，并觀察肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

本研究結(jié)果顯示，XPD高表達(dá)可增加P53的表達(dá)，并能抑制肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，這與本研究組既往的研究結(jié)果相一致［17-18］;另外，XPD高表達(dá)可降低 Mdm2和 Mdm4的表達(dá)。上述結(jié)果表明，XPD、P53與Mdm2、Mdm4之間存在著相互聯(lián)系，共同影響著肝癌的發(fā)生與發(fā)展，也將為肝癌的治療提供可能的分子作用靶點(diǎn)。

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