潘巍巍， 曹利仙， 徐 營， 沈忠飛， 易發(fā)平， 宋方洲

(1嘉興學院醫(yī)學院生物教研室，浙江嘉興314001;2重慶醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，重慶400016)

子宮頸癌是危害廣大婦女健康最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率明顯升高，僅次于乳腺癌而位居第2位，且呈現(xiàn)年輕化和病變進展快的趨勢。因此，研究預防治療宮頸癌的方法已成為人們關(guān)注的熱點［1-2］。研究表明，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)［3-4］。白細胞介素24(interleukin-24或melanoma differentiation associated gene-7，IL-24/Mda-7)是由Jiang等于1995年用干擾素 β(interferon β，IFN-β)和密執(zhí)毒素(mezerein，MEZ)誘導黑素瘤細胞終末分化時，利用消減雜交克隆得到，其后鑒定為IL-10家族的新成員，感染重組腺病毒并表達IL-24的樹突狀細胞具有較強的腫瘤抑制作用［5-7］。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)由Steinman等于1973年首先發(fā)現(xiàn)，因其成熟時具有特殊的樹突狀外型而得名［8-9］。研究表明，樹突狀細胞可廣泛分布于動物除腦、睪丸以外的所有器官、組織，但含量極少。樹突狀細胞是機體中功能最強的專職抗原遞呈細胞，既能直接激活初始型T淋巴細胞，啟動早期特異性免疫應答，又能誘導免疫耐受，已成為免疫學及相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。本研究以IL-24重組腺病毒(Ad-IL-24)感染小鼠未成熟DCs，制備DCs疫苗，觀察其在體內(nèi)、外產(chǎn)生的特異性抗宮頸癌細胞的免疫效應，為宮頸癌的腫瘤生物治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 Pme I和Pac I限制性內(nèi)切酶購自NEB。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen。DL500 DNA marker、DL2000 DNA marker、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和DNA小量膠回收純化試劑盒購自Axygen Biosciences。Ultrapure TEMED、小牛血清、DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青鏈霉素均購自Invitrogen。DMSO購自Sigma。細胞培養(yǎng)板購自康寧公司。PVDE硝酸纖維膜(Roche)，蛋白marker(Bio-Rad)，DAB顯色試劑盒購自中杉金撟公司，M.O.M試劑盒和ABC試劑盒購自Vector Laboratories。IL-24和β-actin抗體購自Santa Cruz。Cleaved caspase-3抗體購自 Cell Signaling。血管生成相關(guān)蛋白IV型膠原(collagen IV)抗體購自Abcam。各種Ⅱ抗均購自Jackson Laboratory。PE-Annexin V試劑盒購自BD。

1.2 動物 健康C57BL/6小鼠，SPF級，雌性，4～5周齡，體重(18±2)g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。BALB/c裸鼠(6～8周)購自上海斯萊克。裸鼠以SPF級飼養(yǎng)在重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 細胞培養(yǎng) 宮頸癌CaSki細胞和HEK293細胞(重慶醫(yī)科大學提供)以含10%小牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基(1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。0.25%EDTA胰酶消化細胞，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 腺病毒 腺病毒空載體pAd-GFP，帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和IL-24的腺病毒載體pAd-IL-24由重慶醫(yī)科大學提供。

2 方法

2.1 IL-24基因的重組腺病毒特異性感染DCs 小鼠骨髓未成熟DCs的分離和培養(yǎng)見參考文獻［10-11］，我們用已獲得的帶有IL-24基因的腺病毒(Ad-IL-24)［12］感染分離培養(yǎng)第6天的 DCs，2 h后棄去含有病毒的DMEM培養(yǎng)液，更換新鮮的培養(yǎng)液含5 μg/L粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和重組小鼠白細胞介素4(rmIL-4)，培養(yǎng)24 h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達，36 h后收集DCs細胞，提取細胞總蛋白，Western blotting檢測IL-24的表達。

2.2 腺病毒感染DCs誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTLs)的產(chǎn)生 頸椎脫臼處死C57BL/6小鼠(6～8周齡)，無菌取出小鼠脾臟，研磨制成脾細胞懸液，收集細胞加入小鼠淋巴細胞分離液4 mL，800×g離心35 min，取淋巴細胞層，用DMEM/F12完全培養(yǎng)液(10%小牛血清)洗細胞2次，收集非黏附的細胞即為純化的T細胞。將感染腺病毒后的DCs與T細胞以1∶10混合培養(yǎng)于24孔板，加入對照腺病毒和Ad-IL-24(1×105U/L)，收集培養(yǎng)7 d的T細胞作為CTLs效應細胞。

2.3 MTT方法檢測腺病毒轉(zhuǎn)染DCs誘導CTLs對CaSki細胞生長的影響 將CTL效應細胞與CaSki細胞1∶10混合培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后用胰酶消化細胞，用培養(yǎng)液輕輕吹打細胞呈單細胞懸液，血細胞計數(shù)板計數(shù)后，每孔接種3×103個細胞于96孔培養(yǎng)板，同時設空白對照。細胞培養(yǎng)72 h后加入20 μL MTT(5 g/L)，4 ～6 h 后加 DMSO(150 μL/well)，振蕩 10 s，490 nm檢測。每組設3個重復，實驗重復3次。

2.4 PE-Annexin V染色檢測細胞凋亡 將CTL效應細胞與CaSki細胞混合培養(yǎng)(1∶10)，培養(yǎng)24 h后用胰酶消化細胞，收集細胞，用預冷1×PBS洗滌2次，1×binding buffer重懸細胞，取105個細胞放置到5 mL離心管中，分別加入5 μL PE-Annexin V和5 μL 7-氨基放線菌素 D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)混懸細胞，混勻、室溫避光放置10 min，加400 μL 1×binding buffer應用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.5 克隆形成實驗 將CTL效應細胞與CaSki細胞混合培養(yǎng)(1∶10)，培養(yǎng)24 h后用胰酶消化細胞，用培養(yǎng)液將細胞吹打成單細胞懸液，血細胞計數(shù)板計數(shù)，每個6 cm培養(yǎng)皿中種1 000個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)10～14 d，用考馬斯亮藍染色后計算克隆數(shù)(細胞數(shù)目大于50 cells/colony)。

2.6 Transwell細胞遷移實驗 將CTL效應細胞與CaSki細胞混合培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后用胰酶消化細胞，細胞計數(shù)，分別在Transwell培養(yǎng)板上室加入100 μL細胞懸液(3×103個)并加入無血清培養(yǎng)基200 μL，下室加入500 μL有血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，取出上室，用冰預冷的甲醇固定30 min，蘇木素染色30 s，細胞在高倍鏡下(×400)隨機取10個視野計數(shù)，取平均數(shù)。實驗重復3次。

2.7 免疫印跡分析 將CTL效應細胞與CaSki細胞混合培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，用1×PBS將細胞洗滌2次，收集細胞，提取細胞總蛋白，取30 μg總蛋白做 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，1×TBST洗膜3次，每次5 min，分別與內(nèi)參照 β-actin抗體(1∶1 000)、cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)和 IL-24抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次5 min。抗兔的HRP標記的Ⅱ抗(1∶400)室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，雜交反應后應用ECL Western blotting化學發(fā)光試劑盒暗房顯影。

2.8 裸鼠荷瘤模型 雌性裸鼠10只SPF級飼養(yǎng)(6～8周齡)，將裸鼠分成2組，每組各5只。無菌條件下分別給第1組每只裸鼠的背部皮下注射2×106個(Ad-IL-24-DCs)CaSki細胞和給第2組每只裸鼠背部注射(Ad-CON-DCs)的CaSki細胞，30 d后取出裸鼠皮下腫瘤組織，稱重，中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片(5 μm)。HE 染色。

2.9 免疫組化和免疫熒光

2.9.1 免疫組化 石蠟切片經(jīng)二甲苯(3次)、乙醇(3次)脫蠟，每次3 min，水化，3%H2O2避光10 min，0.02 mol/L枸櫞酸鈉抗原修復，95℃ 15 min，冷卻至室溫，用M.O.M試劑盒里鼠IgG封閉液室溫封閉1 h，用1× PBST洗2次，用M.O.M稀釋液孵育5 min，M.O.M 稀釋液配 BrdU(I抗，1∶200)室溫孵育30 min，1× PBST洗3遍，每次3 min，用M.O.M抗鼠IgG試劑孵片10 min(Ⅱ抗)，1×PBST洗3次，每次3 min，ABC試劑盒室溫孵育30 min(Ⅲ抗)，1× PBST洗3次，每次3 min。DAB顯色，終止，逐級脫水，中性樹脂封片。

2.9.2 免疫熒光 冰凍切片經(jīng)PBS洗3次，每次3 min，5%BSA封閉液室溫封閉30 min，用含5%BSA的 PBS配 collagen IV(Ⅰ抗，1∶100)室溫孵育1 h，1×PBS洗3次，每次3 min，抗兔 Cy3Ⅱ抗，避光室溫30 min，1× PBS洗3次，每次3 min，DAPI染色5 min，1× PBS洗3次，每次3 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 感染腺病毒的HEK293細胞和DCs

熒光顯微鏡下觀察，感染對照腺病毒(Ad-CON)和感染帶有 IL-24腺病毒(Ad-IL-24)的人胚腎HEK293細胞均有明顯的GFP表達;空病毒轉(zhuǎn)染的DCs和重組IL-24腺病毒載體轉(zhuǎn)染的 DCs在培養(yǎng)1～2 d后 GFP開始表達，并逐漸增多，見圖 1A。Western blotting結(jié)果顯示，感染Ad-IL-24重組腺病毒組細胞有1條能與IL-24單抗特異性結(jié)合的蛋白印跡條帶，而對照組無特異性條帶，見圖1B。

Figure 1.The expression of IL-24 in HEK293 cells and DCs.A:fluorescence microscopy results for GFP expression in HEK293 cells(×100)and DCs(×200)infected with Ad-CON or Ad-IL-24;B:Western blotting results for the expression of IL-24 in DCs.圖1 IL-24在HEK293細胞和未成熟樹突細胞中的表達

2 Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs抑制CaSki細胞增殖

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用Ad-IL-24-DCs體外誘導的CTLs處理 CaSki細胞，存活的CaSki細胞數(shù)目明顯少于用Ad-CON-DCs處理的細胞數(shù)，見圖2A;MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組CaSki細胞數(shù)目明顯減少，存活細胞數(shù)目僅為對照組的20%，見圖2B。這些結(jié)果表明Ad-IL-24-DCs體外誘導的CTLs對 CaSki細胞有明顯的殺傷作用。

3 Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs促進CaSki細胞凋亡

如圖3A、B所示，對照組CaSki細胞凋亡數(shù)目為(2.30±0.13)%，而實驗組 CaSki細胞凋亡的數(shù)目為(14.70±1.26)%。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3在實驗組CaSki細胞中表達明顯增加，見圖3C。這些結(jié)果表明，Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs促進CaSki細胞發(fā)生凋亡。

4 Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs抑制CaSki細胞克隆形成

如圖4所示，對照組CaSki細胞培養(yǎng)10 d以后考馬斯亮藍染色計數(shù)發(fā)現(xiàn)克隆形成數(shù)目為(105.0±12.0)個，而實驗組CaSki細胞培養(yǎng)10 d形成的克隆數(shù)目僅為(11.0±1.4)個。這一結(jié)果表明Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs可以抑制CaSki細胞的克隆形成。

Figure 2.Ad-IL-24-DCs-induced CTLs inhibited CaSki cell proliferation.A:1×105cells were observed in 6-well paltes for 72 h(×200);B:cells were seeded into 96-well plates(3 000 cells/well)for 72 h and then assessed by MTT assay.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05 vs Ad-CON-DCs.圖2 Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs細胞抑制CaSki細胞增殖

Figure 3.Ad-IL-24-DCs-induced CTLs promoted CaSki cell apoptosis.A:apoptisis of CaSki cells in Ad-CON-DCs and Ad-IL-24-DCs groups were detected by PE-Annexin V;B:quantification of apoptotic cells;C:Western blotting analysis of cleaved caspase-3 protein expression in CaSki cells.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-CON-DCs.圖3 Ad-IL-24-DCs誘導的效應細胞CTLs促進CaSki凋亡

Figure 4.Ad-IL-24-DCs-induced CTLs inhibited CaSki cell colony formation.Colony numbers were counted at day 10 after culture.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜ 0.01 vs Ad-CON-DCs.圖4 Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs抑制CaSki細胞的克隆形成

5 Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs抑制CaSki細胞遷移

如圖5所示，對照組CaSki細胞具有較強的遷移能力，而實驗組CaSki細胞可抑制其遷移，實驗組遷移的細胞為對照組的40%。這表明Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs可以抑制腫瘤細胞遷移。

6 裸鼠皮下成瘤實驗體內(nèi)驗證Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs抑制CaSki細胞增殖

為了在體內(nèi)進一步驗證Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs抑制CaSki細胞的增殖，我們分別在不同裸鼠皮下注射對照組和實驗組的CaSki細胞，30 d后觀察發(fā)現(xiàn)注射實驗組CaSki細胞的裸鼠皮下腫瘤明顯小于對照組，其重量是對照組腫瘤的0.5倍(圖6A)。另外，我們?nèi)〕霾煌闶蟮哪[瘤組織，中性甲醛固定，包埋、切片，通過HE染色發(fā)現(xiàn)對照組腫瘤組織增殖較活躍，細胞核增大，核分裂相增加;免疫組化檢測BrdU發(fā)現(xiàn)，對照組裸鼠腫瘤組織BrdU表達量較高，而實驗組裸鼠腫瘤組織BrdU表達量明顯降低;免疫熒光檢測腫瘤組織中血管生成相關(guān)蛋白collagen IV，發(fā)現(xiàn)對照組裸鼠腫瘤組織collagen IV表達量較高，而實驗組裸鼠腫瘤組織collagen IV表達量明顯降低，見圖6B。這表明Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs可以抑制CaSki腫瘤組織的增殖和血管生成。

討 論

Figure 5.Ad-IL-24-DCs-induced CTLs inhibited CaSki cell migration(crystal violet staining，×200).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-CON-DCs.圖5 Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs抑制CaSki細胞的遷移

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位于女性腫瘤的第2位。全世界每年大約有20萬婦女死于這種疾病，近年來發(fā)病率顯著上升。全球發(fā)病率最高的是南非，其次在亞洲，我國發(fā)病率每年新增發(fā)病數(shù)超過13萬，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的73%～93%。IL-24是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，具有廣譜抗腫瘤活性，對多種組織起源的腫瘤細胞，如:黑素瘤、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等均有顯著的生長抑制效應和誘導凋亡作用，但對正常細胞無明顯毒副作用。而且，它還能在腫瘤組織內(nèi)促進血管內(nèi)皮細胞分化從而抑制血管形成［13］。IL-24是一個分泌型細胞因子，可對周圍癌細胞產(chǎn)生旁觀者殺滅效應，具有刺激免疫系統(tǒng)的功能，還能使某些癌細胞對射線更加敏感［5，15-16］。目前的研究顯示，IL-24基因很可能是一個既抑制腫瘤生長又表達刺激免疫系統(tǒng)的蛋白基因，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個細胞因子類的抑癌基因。在多種組織起源的腫瘤細胞中，IL-24的抗腫瘤效應與 p53、Rb、p16、Ras、Bax和caspase-3的突變狀態(tài)無關(guān)，所以對p53失活的子宮頸癌CaSki細胞系特別適用(這些細胞不能被其它腫瘤抑制基因有效殺滅)。

細胞內(nèi)的許多信號刺激可以誘導細胞發(fā)生凋亡，研究表明，細胞凋亡后期的共同途徑是caspase的激活。激活caspase的主要途徑是各種凋亡誘導因素降低線粒體膜的跨膜電位，導致線粒體膜通透性增加，使細胞凋亡啟動子如細胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子等從線粒體釋放出來，最終激活caspase 3，引起細胞凋亡［17-19］。我們通過多種方法驗證感染IL-24的 DCs誘導的CTLs可以促進 CaSki細胞凋亡，Western blotting檢測了凋亡相關(guān)蛋白 cleaved caspase-3的表達。實驗結(jié)果顯示，感染IL-24的DCs cleaved caspase-3的表達增加，這就表明IL-24感染的DCs誘導的CTLs可以在細胞水平抑制子宮頸癌CaSki的存活。

Figure 6.Ad-IL-24-DCs-induced CTLs inhibited CaSki cell proliferation in vivo.A:CaSki cells with Ad-CON-DCs or Ad-IL-24-DCs(1 ×106cells for each)were subcutaneously implanted into the left and right flanks of nude mice.After 30 days，tumors were removed and weighed.Mean ± SD.n=5.*P ＜ 0.05 vs Ad-CON-DCs.B:hematoxylin and eosin(HE)staining for tumor tissues，immunohistochemical staining for BrdU expression and immunofluorescent staining for collagen IV(red)in tumor tissues［counterstained with DAPI(blue)，×200］.圖6 在裸鼠體內(nèi)Ad-IL-24-DCs誘導的CTLs抑制CaSki細胞增殖

本課題在已有工作基礎上，將帶有IL-24基因的重組腺病毒載體感染DCs后誘導CTLs產(chǎn)生，從而開展對宮頸癌的治療研究。通過研究課題組從體內(nèi)外驗證了IL-24轉(zhuǎn)染DCs誘導產(chǎn)生的CTLs可以對宮頸癌CaSki細胞的生長起到了抑制作用，同時也誘導宮頸癌CaSki細胞發(fā)生凋亡;體內(nèi)成瘤實驗也表明將IL-24轉(zhuǎn)染后的DCs誘導產(chǎn)生的CTLs與宮頸癌CaS-ki細胞共同培養(yǎng)，通過皮下注射裸鼠體內(nèi)，30 d后發(fā)現(xiàn)其明顯抑制裸鼠腫瘤的大小和重量，免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)注射Ad-IL-24-DCs的裸鼠腫瘤組織BrdU的表達量明顯低于對照組。體內(nèi)、外研究結(jié)果表明重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染后的樹突狀細胞可以抑制子宮頸癌細胞的增殖，誘導其發(fā)生凋亡，為臨床治療子宮頸癌提供了理論依據(jù)。

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