曹德雄， 李玉娟， 王 飛， 蘇興文， 曹 林△

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是發(fā)生于手術(shù)后以意識障礙、學(xué)習(xí)記憶力下降為特點的臨床綜合癥，多見于老年病人，可持續(xù)數(shù)周、數(shù)年甚至終身，嚴(yán)重影響了患者的最終恢復(fù)并增加了患者的死亡率［1］。吸入麻醉藥是目前廣泛用于臨床手術(shù)的全麻藥，我們及其他學(xué)者的實驗研究證明，異氟醚，一種常用的吸入麻醉藥，可以引起嚙齒類動物的認(rèn)知功能損傷［2-3］，也有臨床研究報道異氟醚麻醉增加了病人POCD的發(fā)生率［4］，提示吸入麻醉藥可能對POCD的發(fā)生起著一定的作用，所以，尋找干預(yù)吸入麻醉藥引起認(rèn)知功能障礙的方法具有重要的臨床意義。過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)屬于核激素受體，廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞中［5］。PPARγ激動劑具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以減輕多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展［5-6］。近年來的研究顯示:在多種認(rèn)知功能障礙的動物模型中，預(yù)先給予PPARγ激動劑可以改善動物的認(rèn)知功能［7-8］;臨床的調(diào)查研究也發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑可以改善阿爾海默氏病早期的認(rèn)知功能［9］。那么，PPARγ激動劑是否也可以緩解異氟醚引起的認(rèn)知功能障礙呢?目前未見文獻(xiàn)報道。另外，我們前期的研究證明了炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)介導(dǎo)了異氟醚引起的嚙齒類動物的認(rèn)知功能障礙［3］。所以，我們在前期的工作基礎(chǔ)上，研究了吡格列酮(pioglitazone，Pi)，一種高選擇性的PPARγ激動劑，對異氟醚引起老年小鼠認(rèn)知功能障礙的影響及其對小鼠腦組織中炎癥細(xì)胞因子的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 主要儀器與試劑 麻醉氣體檢測儀(Datex)，血氣分析儀(拜爾)，異氟醚(雅培制藥有限公司)，吡格列酮、羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC)和蛋白酶抑制劑(Sigma)，小鼠PPARγ單克隆抗體(Santa Cruz)，兔β-actin多克隆抗體(Sigma)，羊抗小鼠Ⅱ抗、羊抗兔Ⅱ抗(武漢博士德公司)，Bradford蛋白濃度檢測試劑(Bio-Rad)，IL-1β和TNF-α的ELISA試劑盒(R＆D Systems)。

1.2 動物及分組 136只11個月大的雄性C57BL/6J小鼠隨機分成5組:對照組(control，Con)、異氟醚組(isoflurane，Iso)、吡格列酮(10 mg/kg)+異氟醚組(Pi10+Iso)、吡格列酮(20 mg/kg)+異氟醚組(Pi20+Iso)和單純吡格列酮(20 mg/kg)組(Pi20)，除Pi10+Iso組24只外，余各組28只。多數(shù)動物在異氟醚處理結(jié)束后48 h，進(jìn)行恐懼記憶實驗(fear conditioning);部分動物在異氟醚處理結(jié)束后6 h分離大腦皮質(zhì)和海馬，用于檢測PPARγ蛋白的表達(dá)以及炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的量;每組4只動物在異氟醚處理結(jié)束即刻經(jīng)左心室心臟穿刺抽血行血氣分析。

2 方法

2.1 異氟醚暴露 參照我們前期的方法［10］，將小鼠放置于一麻醉箱中，該麻醉箱放置于預(yù)設(shè)溫度為37℃的水浴箱中。麻醉箱進(jìn)氣口與裝有異氟醚揮發(fā)罐的麻醉機連接，出氣口接延長管置于通風(fēng)廚。1.4%異氟醚由氧氣輸送通過該麻醉箱，使用氣體監(jiān)測儀監(jiān)測小鼠呼氣末的異氟醚、氧氣和二氧化碳濃度。異氟醚暴露2 h后，停止吸入異氟醚。Con組和Pi20組中的小鼠放置于相同的麻醉箱中，僅吸氧2 h。

2.2 吡格列酮給藥 小鼠在異氟醚暴露前2 h，灌胃給予10 mg/kg或20 mg/kg吡格列酮。吡格列酮溶于1%CMC，給藥容量為10 mL/kg。Con組和Iso組中的小鼠給予相同容量的1%CMC。

2.3 生理指標(biāo)監(jiān)測 麻醉過程中每隔15 min觀察小鼠的唇色，記錄呼吸頻率，在麻醉結(jié)束時即刻，每組各4只小鼠經(jīng)左心室心臟穿刺抽血行血氣分析。

2.4 恐懼記憶實驗 參照我們以前的方法［3］，異氟醚處理后48 h，動物用于恐懼記憶行為實驗。每只動物被放入一個由70%乙醇擦拭過的測試箱中，箱子放置于相對黑暗的空間，動物遭受3次噪聲+足部電擊(噪聲:2 000 Hz，85 dB，30 s;足部電擊:1 mA，2 s)，每次間隔1 min，電擊是通過測試箱底部的不銹鋼柵傳給動物的，噪聲則由安裝在測試箱頂部的揚聲器發(fā)出。完成訓(xùn)練后，動物在測試箱中恢復(fù)1 min，然后將動物放回飼養(yǎng)籠。24 h后，進(jìn)行情景恐懼記憶測試(context):將動物放回相同的箱子呆5 min，但是沒有噪聲和電擊，每6 s記錄僵住(freezing)行為(即動物除了呼吸運動外，全身其它軀體運動全部停止的狀態(tài))。每只動物發(fā)生僵住行為的百分比按以下公式計算:100×N/T，N指動物發(fā)生僵住行為的次數(shù)，T指可能發(fā)生僵住行為的總次數(shù)。2 h后，進(jìn)行聲音提示的恐懼記憶測試(tone):動物被放置于一個場景、形狀和氣味不同于第1個箱子的測試箱中(這個箱子用1%醋酸擦拭)，該箱子放置在相對明亮的空間。首先動物在這個新箱子中適應(yīng)2 min，然后，開始3個循環(huán)的噪聲刺激，每個循環(huán)持續(xù)30 s，接著是1 min的間歇期(總共4.5 min)，在這4.5 min內(nèi)每6 s記錄動物的僵住行為。僵住行為由攝像頭錄像，由1名不知道實驗分組的人員觀察記錄。這套實驗用于檢測情景相關(guān)(context-related)和聲音相關(guān)(tone-related)的學(xué)習(xí)和記憶功能。

2.5 腦組織樣本的收集 參照我們前期的方法［3］，異氟醚暴露結(jié)束后6 h，動物在異氟醚深麻醉下用生理鹽水行心臟灌注后，斷頭，在冰上迅速分離海馬和皮質(zhì)，用于檢測PPARγ蛋白的表達(dá)、炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的量。

2.6 Western blotting法檢測PPARγ蛋白的表達(dá)新鮮冰凍的腦組織勻漿后提取蛋白，根據(jù)蛋白濃度，各樣本等量蛋白10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，1∶500 PPARγ小鼠單克隆抗體、1∶2 000兔抗β-actin 4℃孵育過夜，1∶2 000Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用ECL(Amersham)進(jìn)行膠片顯影。

2.7 ELISA法檢測IL-1β和TNF-α的量 參照我們前期的方法［3］，分離出的腦組織在冰上用含有蛋白酶抑制劑(10 g/L抑肽酶，5 g/L胃蛋白酶抑制劑，5 g/L亮肽素和1 mmol/L PMSF)的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.3)勻漿，勻漿液在4℃下以13 000×g離心20 min，收集上清，Bradford蛋白濃度檢測試劑檢測每個樣本的蛋白濃度。按照說明書，用檢測IL-1β和TNF-α的ELISA試劑盒來定量樣品中的這些細(xì)胞因子的含量。每個腦組織樣品中的IL-1β和TNF-α的表達(dá)都標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示，用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件處理，組間比較采用隨機區(qū)組設(shè)計的單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠麻醉時生理指標(biāo)的檢測

各組小鼠在麻醉處理過程中唇色紅潤，呼吸均勻，沒有出現(xiàn)呼吸抑制。各組的pH值均在正常范圍內(nèi)，各組比較無明顯差異(P＞0.05)。各組均無缺氧表現(xiàn)及二氧化碳蓄積，各組比較PO2與PCO2無明顯差異(P ＞0.05)，見表1。

表1 各組小鼠麻醉時血氣分析結(jié)果Table 1.Isoflurane exposure did not affect arterial blood gas values significantly(Mean±SD.n=4)

2 小鼠恐懼記憶行為測試結(jié)果

2.1 情景恐懼記憶測試 與Con組比較，Iso組小鼠的僵住行為明顯減少(P＜0.05);與Iso組比較，Pi10+Iso組小鼠的僵住行為雖有增加的趨勢，但差異不明顯(P＞0.05)，而Pi20+Iso組小鼠的僵住行為增加明顯(P＜0.05);單純Pi20組小鼠的僵住行為與Con組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1A。這提示異氟醚損傷了小鼠情景相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能，吡格列酮隨著劑量的增加可以減輕異氟醚引起的小鼠認(rèn)知障礙。

2.2 聲音提示恐懼記憶測試 與Con組比較，Iso組小鼠的僵住行為明顯減少(P＜0.05);與Iso組比較，Pi10+Iso組小鼠的僵住行為雖有增加的趨勢，但差異不明顯(P＞0.05)，而Pi20+Iso組小鼠的僵住行為增加明顯(P＜0.05);單純Pi20組小鼠的僵住行為與Con組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1B。這提示異氟醚損傷了小鼠聲音提示相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能，吡格列酮隨著劑量的增加可以減輕異氟醚引起的小鼠認(rèn)知障礙。

3 小鼠腦組織中PPARγ蛋白的變化

與Con組比較，Iso組皮質(zhì)和海馬中PPARγ蛋白的表達(dá)無明顯變化(P＞0.05);與Iso組比較，Pi10+Iso組皮質(zhì)和海馬中PPARγ蛋白的表達(dá)雖有增加的趨勢，但差異不明顯(P＞0.05)，而Pi20+Iso組和Pi20組皮質(zhì)和海馬中PPARγ蛋白的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，見圖2。這提示吡格列酮隨著劑量的增加可以增加小鼠腦組織中PPARγ蛋白的表達(dá)。

Figure 1.Cognitive functions assessed by fear conditioning.Eleven-month-old male C57BL/6J mice were exposed to or not exposed to 1.4%isoflurane for 2 h with or without 10 mg/kg or 20 mg/kg pioglitazone pretreatment and then subjected to the fear conditioning test 48 h later.A:context fear;B:tone fear.Mean ± SD.n=16.*P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs Iso group.圖1 各組小鼠恐懼記憶實驗結(jié)果

Figure 2. PPARγ protein expression in mouse brain tissues.Eleven-month-old male C57BL/6J mice were exposed to or not exposed to 1.4%isoflurane for 2 h with or without 10 mg/kg or 20 mg/kg pioglitazone pretreatment.Hippocampus and cerebral cortex were harvested 6 h after anesthetic exposure for Western blotting analysis of PPARγ protein expression.Mean±SD.n=4.*P ＜0.05 vs Iso group.圖2 各組小鼠腦組織中PPARγ蛋白的表達(dá)

4 小鼠腦組織中IL-1β的變化

4.1 皮質(zhì)IL-1β的變化 各組皮質(zhì)IL-1β的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3A。

4.2 海馬IL-1β的變化 Iso組海馬IL-1β的水平比Con組增加 (P＜0.05)，Pi20+Iso組 IL-1β的含量比Iso組減少 (P＜0.05)，而Pi20組與Con組比較，IL-1β的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3B。這提示異氟醚增加了小鼠海馬中炎癥細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，20 mg/kg吡格列酮可以抑制異氟醚引起的IL-1β含量的增加。

5 小鼠腦組織中TNF-α的變化

5.1 皮質(zhì)TNF-α的變化 各組皮質(zhì)TNF-α差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3C。

5.2 海馬TNF-α的變化 各組海馬TNF-α差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3D。

討 論

學(xué)習(xí)和記憶功能是認(rèn)知功能的重要方面。為了研究吡格列酮對異氟醚引起老年小鼠認(rèn)知功能障礙的影響，本研究采用了恐懼記憶實驗來檢測動物的認(rèn)知功能?？謶钟洃泴嶒炇怯脕碓u估關(guān)聯(lián)性的學(xué)習(xí)記憶功能的測試，是研究麻醉或麻醉手術(shù)引起的認(rèn)知功能障礙中最常用的行為學(xué)測試［3，11-12］。實驗結(jié)果顯示異氟醚減少了老年小鼠在情景恐懼記憶測試和聲音提示恐懼記憶測試中的僵住行為，表明異氟醚損傷了老年小鼠的認(rèn)知功能;而吡格列酮，隨著其劑量的增加減輕了異氟醚引起的老年小鼠的認(rèn)知功能障礙。

本研究中我們選用1.4%異氟醚麻醉2 h是因為小鼠異氟醚的最小肺泡濃度(minimum alveolar concentration，MAC;指50%的動物對疼痛刺激無體動反應(yīng)的肺泡濃度)為1.4%［13］，而且臨床上多數(shù)手術(shù)全麻時吸入麻醉藥的濃度維持在0.5～1.3信MAC，麻醉時間在2 h以上，所以，我們的研究結(jié)果表明按臨床相關(guān)的方法使用異氟醚，可以損傷老年小鼠的認(rèn)知功能。這一結(jié)果與我們前期及其他學(xué)者的研究結(jié)果一致［2-3］。然而，也有研究顯示異氟醚對嚙齒類動物的認(rèn)知功能無影響，甚至可以改善認(rèn)知功能，尤其是在使用年輕的成年動物時［14-15］，這可能與不同研究中，異氟醚的使用濃度、作用時間的長短，進(jìn)行認(rèn)知功能測試的時間及不同的測試方法有關(guān)。體溫不穩(wěn)定、缺氧和高碳酸血癥可以影響認(rèn)知功能［16］，所以我們在異氟醚麻醉期間對動物保暖，并且血氣分析結(jié)果顯示各組動物的pH值、PaO2和PaCO2無明顯差異，從而排除了這些生理因素對實驗結(jié)果的影響。

Figure 3.IL-1β (A，B)and TNF-α (C，D)contents in mouse brain tissues.Eleven-month-old male C57BL/6J mice were exposed to or not exposed to 1.4%isoflurane for 2 h with or without 20 mg/kg pioglitazone pretreatment.Hippocampus(B，D)and cerebral cortex(A，C)were harvested 6 h after anesthetic exposure for ELISA of IL-1β and TNF-α contents.Mean ± SD.n=8.*P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs Iso group.圖3 各組小鼠腦內(nèi)IL-1β和TNF-α的含量

吡格列酮屬于噻唑烷酮類化合物，是臨床上治療Ⅱ型糖尿病的主要藥物，也是PPARγ特異性激動劑，使其與核內(nèi)的維甲酸X受體結(jié)合形成異源二聚體，再與靶基因啟動子中的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合，導(dǎo)致DNA轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄合成后的蛋白酶通過不同的信號通路參與多種生理作用［5］。吡格列酮可以減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺血性損傷［5］，也可以減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?nèi)缗两鹕喜〉陌l(fā)展［6］。最近有動物實驗顯示吡格列酮可以減輕東莨菪堿引起的認(rèn)知損傷［7］，也有研究證明吡格列酮減輕了嗎啡誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知功能障礙［8］。本研究中我們觀察了不同劑量吡格列酮(0、10和20 mg/kg)對異氟醚認(rèn)知損傷的影響及腦組織中PPARγ的表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示:吡格列酮隨著劑量的增加，有逐漸減輕異氟醚引起認(rèn)知損傷的趨勢和增加腦組織中PPARγ表達(dá)的趨勢;當(dāng)吡格列酮的劑量增加到20 mg/kg時，異氟醚引起的認(rèn)知損傷明顯減輕，同時PPARγ表達(dá)水平明顯增加。由于Iso組與Con組比較，PPARγ表達(dá)水平?jīng)]有差異，說明異氟醚引起的認(rèn)知損傷不一定與PPARγ的激活有關(guān);而單獨使用20 mg/kg吡格列酮或合用異氟醚都可以增加PPARγ的表達(dá)，說明吡格列酮改善認(rèn)知功能損傷可能與PPARγ表達(dá)的增加有關(guān)。

異氟醚引起認(rèn)知功能損傷的機制目前尚未完全明確，有研究證明神經(jīng)炎癥反應(yīng)可以損傷認(rèn)知功能［17］。IL-1β和TNF-α是主要的炎癥細(xì)胞因子。實驗證明IL-1β可以引起認(rèn)知功能損傷［18］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn):異氟醚麻醉可以增加嚙齒類動物海馬IL-1β的水平并損傷其認(rèn)知功能，卻不損傷IL-1β缺乏小鼠的認(rèn)知功能，表明IL-1β介導(dǎo)了異氟醚引起的認(rèn)知損傷［3］。在對小鼠行脛骨開放性手術(shù)后認(rèn)知功能障礙的研究中也發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬中IL-1β水平明顯增加，而預(yù)先使用IL-1受體拮抗劑抑制IL-1β的作用可以減輕小鼠的術(shù)后認(rèn)知功能障礙［13］。以上的研究表明IL-1β水平的增加在麻醉或手術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。本研究中，異氟醚麻醉引起了老年小鼠認(rèn)知功能障礙，也引起了海馬IL-1β的增加，而20 mg/kg吡格列酮在減輕異氟醚引起認(rèn)知損傷的同時，也抑制了異氟醚引起的IL-1β水平的增加，再次證明了IL-1β在異氟醚引起的認(rèn)知損傷中起著重要作用。與我們前期［3，19］及其他學(xué)者［13，20］的研究結(jié)果一致，本研究中異氟醚沒有引起小鼠皮質(zhì)IL-1β的變化，這可能由于海馬比皮質(zhì)對異氟醚更為敏感所致。TNF-α在認(rèn)知功能中的作用尚無定論，有研究認(rèn)為TNF-α啟動了細(xì)胞因子的級聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致小鼠的術(shù)后認(rèn)知功能下降［12］，也有研究顯示TNF-α在炎癥反應(yīng)引起的認(rèn)知損傷中無明顯作用［21］。本研究中，我們沒有觀察到異氟醚處理后6 h小鼠海馬和皮質(zhì)中 TNF-α的改變，與我們前期［3，19］及其他學(xué)者［13，20］的研究結(jié)果一致，但是我們可能需要檢測其它時點的TNF-α來確定異氟醚對TNF-α表達(dá)的影響和TNF-α在異氟醚引起認(rèn)知損傷中的作用。

雖然目前我們并不清楚異氟醚是如何引起腦內(nèi)IL-1β增加的，但是最近有研究證明:異氟醚可以引起神經(jīng)細(xì)胞 NF-κB 的激活［22］。而 NF-κB 的激活可以增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生［23］，所以我們推測異氟醚可能是通過激活NF-κB而增加了細(xì)胞因子IL-1β的水平。另一方面，NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，是核激素受體PPARγ的靶目標(biāo)，PPARγ的激活可以抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，從而減少其下游一些重要炎癥細(xì)胞因子如IL-1β的表達(dá)［24］。本研究中，20 mg/kg吡格列酮增加了老年小鼠腦組織中PPARγ蛋白，也抑制了異氟醚引起的IL-1β的增加，那么吡格列酮是否通過PPARγ抑制了異氟醚引起的IL-1β水平的增加，從而減輕了異氟醚引起的認(rèn)知功能障礙呢?有待于我們進(jìn)一步研究。

本研究也存在一定的局限性，沒有使用PPARγ的拮抗劑來進(jìn)一步證實吡格列酮是通過PPARγ來減輕異氟醚引起的認(rèn)知功能障礙，沒有確定PPARγ與IL-1β表達(dá)水平之間的因果關(guān)系，我們在后續(xù)的研究中將繼續(xù)完善?？傊狙芯拷Y(jié)果證明了吡格列酮可以減輕異氟醚引起的老年小鼠的認(rèn)知功能障礙，其機制可能是增加了腦組織中PPARγ蛋白的表達(dá)并抑制了異氟醚引起的IL-1β水平增高。

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