王 羿， 柏 帥， 徐旖旎， 江 滟， 陶 玲， 劉興德， 沈祥春△

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是由多種因素導(dǎo)致的、當(dāng)今世界上威脅人類生命最嚴(yán)重的疾病之一。近年來心血管疾病的發(fā)生率呈逐漸增長的趨勢，患者群體呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的生活質(zhì)量和壽命。高交感活性作為心血管系統(tǒng)疾患的關(guān)鍵因素備受關(guān)注［1］。大量研究證實(shí)，氧化應(yīng)激貫穿于高交感活性誘發(fā)心血管系統(tǒng)疾病的全過程。但是，對高交感活性誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生機(jī)制，目前存在很大爭議。很多資料認(rèn)為，兒茶酚胺類物質(zhì)的自身氧化是高交感活性誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因素。本研究以NE復(fù)制心肌損傷模型，采用受體阻斷劑系統(tǒng)分析氧化應(yīng)激產(chǎn)生的根源［2］，為臨床高交感活性誘發(fā)心肌損傷受體依賴性提供新的理論與實(shí)驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠70只，雌雄各半，體重(220±10)g，購自貴陽醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗中心，動物合格證號為SCXK(黔)2012-001。

1.2 主要儀器 TDL-4ZB臺式自動平衡離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司);BS223S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);TGLL-18G臺式高速冷凍離心機(jī)(太倉市醫(yī)療器械廠);722光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠);XW80-A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

1.3 主要試劑 重酒石酸去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)購自河南新宜醫(yī)藥集團(tuán)精細(xì)化工有限公司;鹽酸普萘洛爾(propranolol，Pro)購自上海辛帕斯制藥有限公司;鹽酸哌唑嗪(prazosin，Praz)購自北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司;維生素E(vitamin E，VE)購自上海信誼延安藥業(yè)有限公司;過氧化物酶(catalase，CAT)、微量丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒和羥脯氨酸試劑盒(堿水解法)購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 動物的分組與模型復(fù)制 為了探測高交感活性誘導(dǎo)心肌損傷的氧化應(yīng)激與受體調(diào)控的關(guān)系，將實(shí)驗分為以下 7 組，即 control、model、Pro、Praz、Pro+Praz、Pro+Praz+VE和VE組，每組10只健康SD大鼠。Control組腹腔注射生理鹽水(normal saline，NS)，其余均腹腔注射 NE 1.5 mg·kg-1，每天2次，連續(xù)腹腔注射16 d［3］復(fù)制心肌損傷模型。自造模之日起腹腔注射干預(yù)藥物，每天2次，給藥方法見表1。

大鼠均自由飲水進(jìn)食，環(huán)境溫度為(22±5)℃。末次給藥60 min后，用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。

2.2 體重變化的測定 注射NE后第3、6、9、12和15天各測1次體重，觀察NE和藥物對大鼠體重的影響。

2.3 心肌重量參數(shù)的測定 大鼠脫頸處死后，迅速開胸取出心臟，表面吸干后，稱心臟重量，在冰冷環(huán)境下剪去心房及右心室后測左心室重量，計算全心指數(shù)及左心指數(shù)。全心指數(shù)=全心重(HW)/體重(BW)，左心指數(shù)=左心室重(LVW)/體重(BW)。

2.4 病理組織學(xué)觀察 待左心室稱重完后，取左心室心尖部位一小塊組織于10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、4 μm厚切片用HE染色、封片，光鏡下觀察心肌病理變化。在BI2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)觀察病理切片的心肌纖維及間隙的變化，并進(jìn)行拍照。

2.5 左心室MDA、SOD和羥脯氨酸含量檢測 取出大鼠左心室，以10倍量生理鹽水在冰浴下制成10%的心臟勻漿，于4℃、1 000 r/min離心10 min棄去沉淀后，取上清按試劑盒說明測MDA、SOD和羥脯氨酸含量。

2.6 左心室 T-AOC和 CAT、GSH-Px、Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性的檢測 心臟勻漿方法同上，取上清按試劑盒說明書的操作步驟測定TAOC 和 CAT、GSH-Px、Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase的活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠體重的變化

連續(xù)腹腔注射 NE，第9、12天與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，第15天差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);第9、12、15天動物體重除 Pro+Praz+VE組和VE組外，其余各組動物體重均明顯增加，與模型組比較差異顯著(P＜0.05或 P＜0.01)，見圖 1。

Figure 1.Changes of the body weight of the rats in different groups.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group.圖1 各組大鼠體重的變化

2 各種藥物干預(yù)對NE誘導(dǎo)的心肌損傷大鼠全心指數(shù)、左心指數(shù)和羥脯氨酸含量的影響

NE(1.5 mg·kg-1)連續(xù)腹腔注射16 d后，模型組的HW/BW與LVW/BW較對照組顯著增加(P＜0.01);各給藥組與模型組比較均明顯降低全心及左心指數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Pro+Praz降低效果最明顯，且與Pro比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);模型組羥脯氨酸含量較對照組明顯升高(P＜0.01)，各給藥組羥脯氨酸含量較模型組有所下降(P＜0.01)，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠心指數(shù)和羥脯氨酸含量的變化Table 2.Changes of rat heart indexes and the content of hydroxyproline (Mean±SD.n=10)

3 各組大鼠心肌病理組織學(xué)的變化

病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，模型組心肌纖維增粗，細(xì)胞核有畸形，心肌橫紋尚清，肌原纖維排列較松。采用BI2000型細(xì)胞醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)可見模型組細(xì)胞間隙增加，心肌纖維排列紊亂等病理特征表現(xiàn)，而給藥各組均具有不同程度的減輕，見圖2。

4 各組大鼠心肌SOD活性和MDA含量的變化

連續(xù)給予NE 16 d后模型組的SOD活性較對照組明顯降低(P＜0.01)，而MDA含量較對照組明顯升高(P＜0.01)，除Pro+Praz+VE組外，各給藥組的SOD活性均明顯升高，與模型組比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，組間兩兩比較Pro+Praz組明顯優(yōu)于Pro+Praz+VE組(P＜0.01);Pro+Praz組的MDA明顯低于VE組 (P＜0.05)，見表3。

Figure 2.HE staining of rat myocardial tissues(×400).圖2 大鼠心肌組織HE染色

表3 各組大鼠心肌SOD活力和MDA含量的變化Table 3.Changes of the activity of SOD and content of MDA in the rat myocardium(Mean±SD.n=10)

5 各組大鼠心肌CAT、GSH-Px活性和T-AOC的變化

連續(xù)給予NE 16 d后模型組的CAT、GSH-Px活性和T-AOC較對照組明顯降低(P＜0.01);Praz組、Pro+Praz組、VE組與模型組比較，CAT及GSH-Px活性有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)，Pro+Praz組的GSH-Px活性明顯高于Pro組和Pro+Praz+VE組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);各給藥組的TAOC較模型組均升高且差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，其中 Pro+Praz組升高最明顯，與 Pro組和Praz組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 各組大鼠心肌CAT、GSH-Px活性和T-AOC的變化Table 4.Changes of the activity of CAT and GSH-Px，and T-AOC in the rat myocardium［103U/(g protein).Mean ±SD.n=10］

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs Pro group;▲P ＜0.05 vs Praz group;○P＜0.05 vs Pro+Praz group.

6 各組大鼠心肌Na+-K+ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase活性的變化

連續(xù)給予NE 16 d后，測定Na+-K+ATPase及Ca2+-Mg2+ATPase的活性顯示，模型組較對照組明顯降低，差異顯著(P＜0.01);Praz組和Pro+Praz組的Na+-K+ATPase及 Pro組、Praz組、Pro+Praz組 的Ca2+-Mg2+ATPase活性明顯增加，與模型組比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，Praz組和Pro+Praz組的Na+-K+ATPase活性明顯高于Pro+Praz+VE組(P＜0.05或P＜0.01)，見表5。

表5 各組大鼠心肌Na+-K+ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase活性的變化Table 5.Changes of the activity of Na+-K+ATPase and Ca2+-Mg2+ATPase［103U/(g protein).Mean±SD.n=10］

討 論

心肌損傷發(fā)生的機(jī)制較為復(fù)雜，目前大量研究表明高血壓、冠心病及心肌梗死等疾病過程中，血中兒茶酚胺水平增高，激動α和β受體，使交感活性增強(qiáng)，而長時間的高交感活性可進(jìn)一步加重心血管疾?。?］。有文獻(xiàn)報道，高交感活性誘發(fā)心血管系統(tǒng)疾病中存在氧化應(yīng)激。本實(shí)驗擬以腎上腺素受體阻斷劑及抗氧化劑之間的系統(tǒng)分析，闡明受體阻斷與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系。

本實(shí)驗選采用的Pro是一個非選擇性β受體阻斷劑，Praz是α受體阻斷劑，VE是與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的抗氧化劑。

對各組大鼠體重記錄結(jié)果可以看出，高交感活性可以在一定程度上影響大鼠的生長，而給予受體阻斷劑后，可改善其生長狀況。

雙重阻斷劑組Pro+Praz降低心指數(shù)的效果最明顯，且與Pro+Praz+VE組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;各給藥組的羥脯氨酸含量與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示阻斷α和β受體能一定程度上降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。

ROS過量生成和(或)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的受損可引起氧化應(yīng)激，對細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用［5］。體內(nèi)ROS主要包括O2-·、·OH、H2O2等。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量反映脂質(zhì)過氧化損傷的程度。SOD是體內(nèi)一線清除ROS的酶類，SOD可以快速將O2-·轉(zhuǎn)變成為相對活性較低的H2O2，進(jìn)一步由CTA和GSH-Px降解。T-AOC是抗氧化能力指標(biāo);另一方面，適度的氧化應(yīng)激狀態(tài)可以刺激抗氧化酶的表達(dá)［6］。本實(shí)驗結(jié)果表明，各給藥組MDA含量均有不同程度降低，其中使用雙重阻斷劑Pro+Praz降低最明顯;抗氧化指標(biāo)SOD、CAT、GSH-Px及T-AOC的結(jié)果顯示除Pro+Praz+VE組外其余各組均較模型組增高;說明Pro+Praz改善氧化損傷效果最好，提示高交感活性誘導(dǎo)心肌氧化/抗氧化失衡引起的氧化應(yīng)激損傷與受體是密切相關(guān)的。

心肌Na+-K+ATPase通過分解ATP轉(zhuǎn)運(yùn)Na+-K+和Na+-Ca2+。Na+-K+ATPase酶活性下降會引起胞內(nèi)Ca2+增加;Ca2+-Mg2+ATPase活性下降主要導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外Ca2+、Mg2+分布失衡，最終引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載［7］，而Ca2+是一種強(qiáng)解偶聯(lián)劑，可使線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)，造成能量障礙［8］。本實(shí)驗結(jié)果證實(shí)模型組的ATPase活性較對照組明顯降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Pro、Praz和Pro+Praz可以明顯改善ATPase的活性。說明高交感活性可通過受體通路引起心肌能量代謝障礙損傷心肌。并且心肌鈣超載、能量代謝障礙可激活心肌重構(gòu)的下游通路，引發(fā)心肌肥厚。實(shí)驗結(jié)果提示受體阻斷藥還能從能量代謝途徑改善心肌重構(gòu)。

高交感活性引起心肌氧化損傷的病理發(fā)展過程較復(fù)雜，涉及多種因素、多種通道共同參與。本實(shí)驗結(jié)果提示，在高交感活性時，NE可通過 α-和β-AR通路引起心肌重構(gòu)、氧化/抗氧化能力失調(diào)、能量障礙，而受體阻斷藥從這3個方面進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)高交感活性誘導(dǎo)大鼠心肌損傷模型中氧化應(yīng)激與受體機(jī)制密切相關(guān)，這為臨床合理用藥提供了的理論支持與防治策略。

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