趙曉玲 ，張鑫瑤 ，何春年 ，彭 勇

(1．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193; 2．國家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

地骨皮為茄科植物枸杞 Lycium chinense Mill．或?qū)幭蔫坭絃ycium barbarum L．的干燥根皮，主產(chǎn)于山西、陜西、寧夏以及華北等地，味甘，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)[1]。地骨皮為常用中藥，具有涼血除蒸、清肺降火的功能，用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽、咯血、內(nèi)熱消渴等癥[2]。從20世紀(jì)80年代開始，對地骨皮進(jìn)行了一系列化學(xué)成分和藥理活性研究，發(fā)現(xiàn)其主要成分包括黃酮、有機(jī)酸、多肽類、甾醇、香豆素和揮發(fā)油等，藥理作用主要為降血壓、降血糖、解熱和鎮(zhèn)痛等。然而，迄今地骨皮有效成分尚不明確，《中國藥典》也沒有含量測定項(xiàng)[3]。為了更好地控制地骨皮藥材質(zhì)量，本試驗(yàn)對地骨皮中有較明確藥理活性的地骨皮甲素/乙素和阿魏酸兩類化合物進(jìn)行含量測定研究。

地骨皮甲素和地骨皮乙素(結(jié)構(gòu)見圖1)屬于精胺生物堿。地骨皮甲素、乙素體外可以從源頭阻斷細(xì)胞的炎癥活化，避免免疫反應(yīng)紊亂，體內(nèi)可對脂多糖和CpG DNA發(fā)揮拮抗作用，因此地骨皮甲素、乙素是糾正免疫紊亂、發(fā)揮防止膿毒癥和自身免疫性疾病作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4];另外，還具有錐蟲基硫還原酶抑制[5]和細(xì)菌內(nèi)毒素拮抗[6]等活性。地骨皮甲素和乙素同時(shí)存在于中藥地骨皮中，是主要的降血壓有效成分[7];兩者系同分異構(gòu)體，在常規(guī)色譜條件下難以分離[8-9]。同時(shí)，兩者藥理活性均非常明顯，因此在本試驗(yàn)中作為同一指標(biāo)進(jìn)行測定。

圖1 化學(xué)結(jié)構(gòu)式

阿魏酸(結(jié)構(gòu)見圖1)是植物中廣泛分布的一種芳香酸，具有抗血小板聚集、抑制血小板5-羥色胺釋放、抑制血小板血栓素A2的生成[7]、增強(qiáng)前列腺素活性、鎮(zhèn)痛、緩解血管痙攣等作用[8]。因此，在本試驗(yàn)中采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)法同時(shí)測定了不同來源地骨皮藥材中地骨皮甲素、乙素和阿魏酸含量，比較分析其含量在該藥材中存在的一般規(guī)律，以期為該藥材的質(zhì)量控制、評價(jià)以及資源開發(fā)利用等提供一定依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括 G1322A型在線脫氣機(jī)、G1311A型液相泵、G1329A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B型DAD檢測器、Agilent色譜工作站;UV2550型紫外光譜儀(日本島津公司);AL204型梅特勒-托利多電子天平;DTC-21型ULVAC薄膜真空泵;C9860A型超聲波清洗器(上海杰恩普超聲設(shè)備有限公司)。色譜純?yōu)橐译?美國Honeywell B＆JACS公司)，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。地骨皮乙素對照品(批號為12021708)、阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100519)。地骨皮藥材包括筆者采集的來源于野生和栽培的品種及購自全國各大藥店的樣品，經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所彭勇研究員鑒定為枸杞 Lycium chinense Mill．或?qū)幭蔫坭?L．barbarum L．的干燥根皮。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:Synergi 4u Hydro-RP 80A柱(250 mm ×4．6 mm，4 μm);流動相:乙腈(A)-0．5%三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～3 min時(shí) 10%A，3～10 min時(shí) 10% ～12%A，10～20 min時(shí)12% ～14%A，20～35 min時(shí) 14% ～15%A;流速:1．0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:278 nm;進(jìn)樣量:10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2．2 溶液制備

精密稱取地骨皮甲素對照品13．67 mg、地骨皮乙素對照品27．34 mg，阿魏酸對照品 2．30 mg，分別置 1，10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含地骨皮甲素13 670 μg、地骨皮乙素27 340 μg和阿魏酸230 μg的對照品溶液。取本品粉末約1．5 g，精密稱定，置30 mL西林瓶中，加甲醇15 mL，冷浸1 h，40℃超聲處理1 h，靜置，放冷至室溫，濾過，用10 mL甲醇分2次洗滌殘?jiān)?，過濾，合并兩次濾液，蒸干;殘留物用甲醇分次溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，并定容置刻度，搖勻，過0．45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取地骨皮乙素對照品溶液，將其依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為 27 340．0，13 670．0，1 367．0，273．4，136．7 μg/mL，將阿魏酸對照品溶液依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為230．0，57．5，23．0，11．5，4．6 μg/mL，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，地骨皮乙素為 Y=2．462 2X-329．607 3，r2=0．999 5(n=5)，阿魏酸為 Y=23．5955X-5．8775，r2=1．0000(n=5)。結(jié)果表明，地骨皮乙素與阿魏酸質(zhì)量濃度線性范圍分別為136．7～27340μg/mL和 4．6 ～230 μg/mL。

精密度試驗(yàn):精密吸取供試品(32號樣品)溶液，按擬訂色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果地骨皮乙素與阿魏酸峰面積積分值的 RSD分別為0．54%和0．92%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取32號地骨皮樣品粉末1．5 g，共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件檢測。結(jié)果地骨皮乙素和阿魏酸峰面積積分值的 RSD分別為1．61%和1．05%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取供試品(32號樣品)溶液，室溫下，分別于制樣后 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果地骨皮乙素和阿魏酸峰面積的 RSD分別為 0．65% 和2．23%(n=6)，表明供試品溶液中地骨皮乙素和阿魏酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的32號地骨皮樣品各9份，每份約1．5 g，精密稱定，分別加入定量地骨皮乙素和阿魏酸對照品，依法制備供試品溶液，測定樣品中地骨皮乙素和阿魏酸含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2．4 樣品含量測定

精密吸取各批次供試品溶液10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中地骨皮乙素和阿魏酸的含量，結(jié)果見表2?？梢?，在野生的8個(gè) L．chinense樣品中，山西、陜西和寧夏的樣品1，2，3，5，6 號中地骨皮乙素含量較高，均不低于 8．969 mg/g，但阿魏酸含量不一，含量最低值8．602 μg/g出現(xiàn)在5號的山西樣品中;在3個(gè)栽培的 L．barbarum樣品中，地骨皮乙素的含量均相對較高，介于9．090～15．026 mg/g，而阿魏酸含量則處于中等偏下水平，均小于11．292 μg/g;在市售的33個(gè)樣品中，產(chǎn)地為安徽、內(nèi)蒙古和湖南的 12，13，14，33，34，41，42 號樣品中地骨皮乙素的含量均在1 mg/g以下，含量相對較低，呈現(xiàn)了一定的地域規(guī)律，除兩個(gè)北方的內(nèi)蒙樣品外，其他均為南方購買藥材，而阿魏酸含量則介于 10．208 ～34．336 μg/g，無明顯的地域差異。分析L．chinense和 L．barbarum這兩個(gè)種間的地骨皮乙素和阿魏酸含量，L．chinense中地骨皮乙素的含量相對偏高，除了上述提到的地域差別外，只有17，20，25號樣品中地骨皮乙素含量低于5 mg/g;而 L．barbarum中除38號樣品地骨皮乙素的含量為8．609 mg/g外，其他樣品的含量均低于5．021 mg/g，兩個(gè)種間阿魏酸含量的4 個(gè)最高值都出現(xiàn)在 L．chinense樣品中，分別是 27，32，36，37 號樣品。

表2 樣品中阿魏酸含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

本試驗(yàn)采用了不同比例的甲醇、乙醇為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，發(fā)現(xiàn)甲醇提取的粗提物中雜質(zhì)峰相對較少;考察了不同流動相及添加酸水種類，發(fā)現(xiàn)以乙腈和含0．5%三氟乙酸作為流動相檢測，地骨皮乙素和阿魏酸色譜峰分離度好，無干擾，因此選擇乙腈-0．5%三氟乙酸水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。此外，本試驗(yàn)也比較了不同檢測波長，發(fā)現(xiàn)在278 nm波長處地骨皮乙素具有最大吸收，同時(shí)阿魏酸也有較好的分離度且峰形較好，可較準(zhǔn)確地測定含量，因此選擇278 nm作為檢測波長[10]。

本試驗(yàn)測定的地骨皮甲素、乙素和阿魏酸各有其特有的生物活性。地骨皮甲素是錐蟲基硫還原酶的有效抑制劑[4]，地骨皮乙素是一種新型的天然抗敗血癥劑[11]，且兩者在地骨皮中的含量較大;而阿魏酸作為一種化感物質(zhì)，在根內(nèi)可以表現(xiàn)出抑制競爭性植物生長的作用[12]，在枸杞栽培的過程中可能會產(chǎn)生一定的影響。此外，地骨皮甲素和乙素兩者系同分異構(gòu)體，紫外檢測條件下在同一保留時(shí)間出峰(見圖2)[8-9]。鑒于此，本試驗(yàn)在前期準(zhǔn)備中利用紫外分光光度計(jì)測定并計(jì)算相同條件下兩者的摩爾吸光系數(shù) ε，分別為 1．69 ×105L/(mol·cm)和 1．68 ×105L/(mol·cm)，兩者差別不大。如圖2所示，在購買到的對照品中地骨皮甲素的純度只有85%，因此本試驗(yàn)將地骨皮甲素和乙素作為一個(gè)指標(biāo)，以地骨皮乙素作對照品進(jìn)行成分含量的共同標(biāo)定，試驗(yàn)結(jié)果證明該方法是可行的。結(jié)合含量測定結(jié)果，將地骨皮甲素、乙素作為地骨皮質(zhì)量控制的特征性指標(biāo)是合適的，且地骨皮中地骨皮甲素、乙素以地骨皮乙素計(jì)，含量不應(yīng)低于1 mg/g。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:115．

[2]周興旺，徐國鈞，王 強(qiáng)，等．常用中藥材品種整理與質(zhì)量研究(南方篇)[M]．福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社，1988:656-676．

[3]陳遠(yuǎn)良．地骨皮等6種中藥飲片偽品的鑒別[J]．中國藥業(yè)，2009，18(18):77-78．

[4]鄭 江，劉 鑫，鄭新川，等．苦柯胺A和苦柯胺B的用途:中國，201010156503[P]．2011-11-03．

[5]Ponasik JA，Strickland C，F(xiàn)aerman C，et al．Kukoamine A and other hydrophobic acylpolyamines:potent and selective inhibitors of Crithidia fasciculata trypanothione reductase[J]．Biochem．J．，1995，311:371-375．

[6]楊景程，劉 鑫，鄭新川，等．苦柯胺B拮抗細(xì)菌內(nèi)毒素和CpG DNA的實(shí)驗(yàn)研究[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(11):1 062-1 066．

[7]余競光．中藥地骨皮的降血壓成分——新生物堿地骨皮甲素[J]．國外醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊，1981(1):6．

[8]Funayama S，Yoshida K，Konno C，et al．Structure of Kukoamine A，a hypotensive principle of Lycium chinense root barks[J]．Tetrahedron Lett，1980，21(14):1 355-1 356．

[9]Funayama Shinji，Zhang Gui-Rong，Nozoe Shigeo．Kukoamine B，a spermine alkaloid from Lycium chinense[J]．Phytochemistry，1995，38(6):1 529-1 531．

[10]劉 翔，曹云飛，竇金鳳．不同產(chǎn)地旱墨蓮中木樨草素含量測定[J]．中國藥業(yè)，2007，16(23):12-13．

[11]Liu X，Zheng X，Long Y，et al．Dual targets guided screening and isolation of Kukoamine B as a novel natural anti-sepsis agent from traditional Chinese herb Cortex lycii[J]．Int Immunopharmacol，2011，11(1):110-120．

[12]Ben-Hayyim G，Damon JP，Martin-Tanguy J，et al．Changing root system architecture through inhibition of putrescine and feruloyl putrescine accumulation[J]．FEBS Lett，1994，342(2):145-148．