黃炯威，莫世藝，劉 寧，梁劍鋒，劉桂禎

(1．開平牽牛生化制藥有限公司，廣東 江門 529339;2．廈門大學生命科學院，福建 廈門 361000)

核苷類似物的合成主要有化學合成法、堿基修飾法和生物轉化法3種方法[1]，前兩者工藝步驟多、反應條件苛刻、周期長、總收率偏低、成本居高不下，而酶法具有反應條件溫和、反應專一性強、副反應少、產物容易分離純化等優(yōu)點。核甘磷酸化酶已被廣泛用于酶法合成抗腫瘤、抗病毒的核苷類似物[2]。核苷磷酸化酶可分為嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase，EC2，4，2，1)和嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase，EC2，4，2，2)[3]。此酶能可逆地催化核苷(或脫氧核苷)磷酸化反應[4]。利用核苷磷酸化酶已成功合成了阿糖腺苷(Ara2A)、2'－ 脫氧腺苷(2'－ Deoxyade nosine，dAR)、三氮唑核苷(Ribavirin)、5－氟尿苷(5－FUR)等。但利用含有核苷磷酸化酶的天然菌株合成核苷類藥物存在酶量小的缺點，構建基因工程菌的方法可從根本上解決酶量問題。本實驗室獲得了2株含嘌呤核苷磷酸化酶與嘧啶核苷磷酸化酶基因的工程菌，對產酶條件進行了詳盡地研究。通過優(yōu)化工程菌的產酶條件，現(xiàn)1 L發(fā)酵液可得2 g以上的酶蛋白，解決了酶的來源問題，為酶法合成核苷類似物提供了堅實的基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

BMR－A50U型50 L發(fā)酵罐(上海傲中生物工程設備有限公司);JY92－11N型超聲波細胞粉碎機(寧波新藝超聲設備有限公司);VE－180型電泳槽(上海天能公司)，WD－9413B型凝膠成像分析儀(北京六一儀器廠)。菌種Gne01(PNPase工程菌)、菌種Gne02(PyNPase工程菌)為本實驗室自有;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Merck公司);培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基;其他檢測用試劑為國產分析純。

1．2 方法[5]

培養(yǎng)方法(搖瓶):在500 mL三角瓶中裝入60 mL含單磷酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基，按2%的量接入種子液，在適宜溫度培養(yǎng)一定時間后加入IPTG誘導蛋白表達，培養(yǎng)完成后收獲菌體。

菌體測定方法:取一定量的發(fā)酵液置離心管中，以4 000 r/min的速率離心10 min，倒出上清液，稱量離心沉淀的菌體質量，計算出單位發(fā)酵液中菌體的質量。

總蛋白測定方法:收獲的菌體用超聲波粉碎機破碎，以4 000 r/min的速率離心15 min，取上清液為待測樣品，以牛血清白蛋白(BSA)配制標準蛋白溶液，按考馬斯亮藍(Bradford)法制作標準曲線及檢測樣品的蛋白含量。

表達量測定方法:取蛋白測定樣品進行SDS－PAGE電泳，再進行凝膠成像掃描分析，結合總蛋白測定結果可計算出目標蛋白表達量。

50 L發(fā)酵罐發(fā)酵方法:根據(jù)搖瓶培養(yǎng)試驗結果，設計了L9(34)的正交試驗方案，其中選擇了培養(yǎng)溫度、誘導開始時間、誘導濃度和誘導時間為主要考察因素進行條件優(yōu)化，研究50 L發(fā)酵罐的最佳發(fā)酵條件。

2 結果

2．1 酶表達影響因素考察

誘導時間:接種后，在搖瓶培養(yǎng)4 h時加入0．4 mmol/L的IPTG誘導，然后繼續(xù)培養(yǎng)10 h，每1 h取樣檢測菌體量和蛋白表達量，結果見圖1?？梢?，菌體在誘導后繼續(xù)快速生長，到誘導后8 h菌體量和蛋白表達量達最高，時間再長菌體量和蛋白表達量都會有小幅度下降，因此誘導后培養(yǎng)8 h菌體量和蛋白表達量均達到了高水平。

圖1 不同誘導時間對菌體量和蛋白表達量的影響

誘導時機:接種后，在搖瓶培養(yǎng) 2，3，4，5，6 h時分別加入0．4 mmol/L的IPTG誘導，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，培養(yǎng)完成后檢查菌體量和蛋白表達量，結果見圖2。可見，誘導時機對菌量和表達量有較明顯的影響，誘導太早會明顯影響菌體生長，從而影響蛋白的表達，誘導太晚雖然對菌體量影響不明顯，但明顯降低了蛋白表達量。因此，最佳的誘導時機是在培養(yǎng)4 h時進行誘導。

圖2 誘導前不同培養(yǎng)時間對菌體量與蛋白表達量的影響

起始pH:配制不同起始pH的LB培養(yǎng)基，按2%的量接入種子液，在32℃培養(yǎng)4 h后加入IPTG誘導蛋白表達，再培養(yǎng)8 h后收獲菌體檢測菌體量和蛋白表達量，結果見圖3?？梢姡囼灧秶鷥扰囵B(yǎng)基起始pH的變化對菌體量和蛋白表達量的影響比較輕微，其中以起始pH在7．0～7．2為最佳條件。

圖3 不同培養(yǎng)基起始pH對菌體量和蛋白表達量的影響

培養(yǎng)溫度:接種后分別在 28，30，32，35，37 ℃培養(yǎng) 4 h，誘導后再培養(yǎng)8 h后收獲菌種，檢測菌體量和目標蛋白表達量，結果見圖4。可見，培養(yǎng)溫度對菌體量和蛋白表達量均有影響，在一定范圍內，溫度越高菌體量越大，蛋白表達量越多，但溫度越高表達蛋白時越容易形成包涵體，因此培養(yǎng)溫度在30℃時為最佳條件。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對菌體量和蛋白表達量的影響

誘導劑濃度:搖瓶接種后在32℃培養(yǎng)4 h，分別加入0．25，0．3，0．35，0．4，0．45，0．5 mmol/L IPTG 誘導，再培養(yǎng) 8 h 收獲菌體，檢測菌體量和蛋白表達量，結果見圖5?？梢?，誘導劑濃度對菌體量和蛋白表達量影響比較明顯，誘導劑濃度的提高可令表達量明顯升高，當誘導劑達到0．4 mmol/L及以上時，蛋白表達量不再明顯升高，但隨誘導劑濃度升高菌體量有一定程度的下降，因此誘導濃度為0．4 mmol/L時菌體量和蛋白表達量可達到較理想的水平。

圖5 不同誘導濃度對菌體量與蛋白表達量的影響

2．2 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件優(yōu)化(正交試驗)

本試驗采用 L9(34)正交試驗方案，其中培養(yǎng)溫度選擇了30，32，35℃ 3個水平，誘導開始時間選擇了3，4，5 h 3個水平，誘導濃度為 0．3，0．4，0．5 mmol/L 3 個水平，誘導時間為 8，9，10 h 3個水平，通過正交試驗以較少的試驗次數(shù)來研究50 L發(fā)酵罐的最佳發(fā)酵條件。試驗結果見表1和表2?？梢?，4個考察因素中誘導濃度對表達量影響最大，其次是培養(yǎng)溫度，影響最小的是誘導時間，為避免因溫度高導致表達蛋白形成包涵體，最終確定50 L發(fā)酵罐的最佳反應條件是培養(yǎng)溫度32℃，接種4 h后加入0．4 mmol/L IPTG誘導，誘導時間為9 h。

表1 Gne01菌種50 L罐發(fā)酵正交試驗結果(n=9)

表2 Gne02菌種50 L罐發(fā)酵正交試驗結果(n=9)

3 討論

通過搖瓶培養(yǎng)試驗考察了Gne01和Gne02 2個基因工程菌發(fā)酵條件，除了考察溫度、pH等條件外，也重點考慮了外源蛋白表達的誘導時機、誘導劑的濃度和誘導時間等條件。由于外源蛋白的表達通常會抑制菌體生長，因此發(fā)酵條件優(yōu)化非常重要。本次考察的2個基因工程菌蛋白表達條件試驗中，誘導劑濃度和誘導的開始時間最重要，培養(yǎng)溫度和誘導時間也對結果有較明顯的影響，而培養(yǎng)基起始pH的影響較弱。

為進一步優(yōu)化工程菌發(fā)酵條件，為核苷磷酸化酶的工業(yè)化生產應用進行更深入研究，根據(jù)搖瓶試驗結果設計了正交試驗方案進行50 L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。結果顯示，各研究因素中對結果影響由大到小依次為誘導劑濃度、培養(yǎng)溫度、誘導時機和誘導時間。50 L發(fā)酵罐的最佳條件為起始pH為7．0～7．2，于32℃培養(yǎng)4 h，加入終濃度為0．4 mmol/L IPTG誘導9 h后收獲菌體，每升發(fā)酵液可得2 g以上的較高水平的酶蛋白表達量，達到了工業(yè)化生產要求。

[1]樊華偉，傅紹軍，邵志宇，等．核苷類藥物酶法合成研究進展[J]．生物技術通訊，2005，16(11):690 －692．

[2]張文偉，馮勝彥．生長溫度對核苷磷酸化酶的影響[J]．氨基酸和生物資源，1999，21(1):27－29．

[3]魏元剛，倪孟祥，葛亞文，等．來源于產氣腸桿菌的嘧啶核苷磷酸化酶基因在大腸桿菌BL21中的表達[J]．藥物生物技術，2007，14(2):94－98．

[4]閆蓬勃，邱蔚然，丁慶豹．核苷磷酸化酶的產酶條件優(yōu)化的研究[J]．藥物生物技術，2001，8(2):83－85．

[5]姜立春，羅 英，韓文君，等．嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]．生物技術通訊，2007，18(3):252 －254．