★ 許可為 朱若凱 蔡佳 陳麗華 吳德智

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江西 南昌330006;2.江西省醫(yī)藥采購(gòu)服務(wù)中心 江西南昌330029;3.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西南昌330004)

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)為衛(wèi)茅科雷公藤屬植物，對(duì)治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡以及腫瘤等自身免疫性疾病療效顯著。雷公藤生物堿類(lèi)成分是雷公藤主要有效成分之一，具有明顯的免疫抑制、抗腫瘤及抗生育等作用，且毒性遠(yuǎn)低于二萜類(lèi)成分，具有良好應(yīng)用前景［1］。文獻(xiàn)報(bào)道［2］以雷公藤總生物堿提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選了雷公藤藥材生物堿的提取工藝，但僅從總生物堿提取率來(lái)考察提取工藝尚存不足。雷公藤吉堿和雷公藤次堿是雷公藤根皮提取物中含量較高的2種生物堿，同時(shí)也是主要的活性成分。因此本實(shí)驗(yàn)以雷公藤總生物堿、雷公藤吉堿、雷公藤次堿的提取率和浸膏得率為指標(biāo)優(yōu)選了雷公藤藥材生物堿的提取工藝，為雷公藤生物堿的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機(jī)、柱溫箱、VWD檢測(cè)器;UV2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);TG328A十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Startorius公司)。

雷公藤藥材(福建漢堂生物制藥股份有限公司);雷公藤吉堿、雷公藤次堿(自制，純度大于98%，面積歸一法測(cè)得);乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司);磷酸二氫鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 雷公藤總生物堿的測(cè)定方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取雷公藤吉堿對(duì)照品7.60mg，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，搖勻，得濃度為304μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液的配制 取正交設(shè)計(jì)供試品溶液8號(hào)，參考文獻(xiàn)方法［2］提取液減壓濃縮，用0.5 mol/L HCl溶液30 mL提取3次，合并酸液，用30 mL氯仿分2次萃取酸水液，棄去氯仿層，酸水中加入濃氨水調(diào)節(jié)pH至7左右，靜置，用濾紙過(guò)濾，加濃氨水調(diào)節(jié)pH至9～11，再用90 mL氯仿分3次萃取至水中無(wú)生物堿為止，合并氯仿液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至干，加入5%HCI溶液并定容至25 mL，即得雷公藤總生物堿供試品溶液。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取雷公藤吉堿對(duì)照液，置于吸收池中，以甲醇溶液為空白，在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，268nm處有最大吸收，故選擇268nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取雷公藤吉堿對(duì)照品溶液1，1.5，2，2.5，3，3.5mL，置于 10mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，搖勻，在268nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光值，以質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為:Y=0.0066X-0.00912，r=0.9993。說(shuō)明雷公堿吉堿濃度在30.4～106.4μg/mL范圍內(nèi)與吸光度A具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，在268nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，連續(xù)重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD為0.11%(n=6)。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24h進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定268nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算RSD為3.57%，結(jié)果顯示供試品溶液在24h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 在已測(cè)定總生物堿濃度的雷公藤藥材提取液中加入已知量約80%、100%、120%的雷公藤吉堿對(duì)照品，制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果雷公藤總生物堿平均回收率為98.74%，RSD為1.54%。

2.1.8 總生物堿提取率的測(cè)定 于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定各提取物溶液在268nm處的吸光度值，根據(jù)線(xiàn)性方程得到總生物堿含量，并按下列公式計(jì)算雷公藤藥材中總生物堿的提取率。

2.2 雷公藤吉堿和雷公藤次堿測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件［3，4］色譜柱:Diamon sil C18(4.6mm ×250mm，5μm);柱溫:25℃;流動(dòng)相為乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀水溶液梯度洗脫:1～12min梯度從55∶45變化為50∶50，12 ～13min梯度從50∶50 變化為 55∶45，13 ～20min 為 55∶45;流速:1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):268nm。進(jìn)樣量:20μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取雷公藤吉堿、雷公藤次堿對(duì)照品5.10，4.80mg，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，搖勻，分別得濃度為204，192μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別精密吸取雷公藤吉堿和雷公藤次堿混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.5，1，2，3，4，5mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進(jìn)樣20μL，以進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性擬合，混合對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1(A)。雷公藤吉堿和雷公藤次堿的線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)分別為:Y=5.190X+3.196，r=0.9994;Y=5.638X+4.473，r=0.9993。結(jié)果表明雷公藤吉堿和雷公藤次堿分別在10.2～81.6μg/mL和9.6～96μg/mL呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值，計(jì)算得雷公藤吉堿和雷公藤次堿的RSD分別為0.97%和0.67%(n=6)。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取正交設(shè)計(jì)供試品溶液8號(hào)，分別于0，2，4，8，12，24h 進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算雷公藤吉堿和雷公藤次堿質(zhì)量濃度，得到RSD分別為1.34%和2.59%，結(jié)果顯示供試品溶液在24h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 在已測(cè)定雷公藤吉堿和雷公藤次堿質(zhì)量濃度的雷公藤生物堿提取液樣品中加入已知量約為80%、100%、120%的混合對(duì)照品，制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果雷公藤吉堿和雷公藤次堿的平均回收率分別為96.03%、103.89%，RSD分別為0.96%、1.63%。

2.3 提取工藝考察 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)考察結(jié)果，提取前浸泡1h，提取次數(shù)確定為2次。將提取液pH值、提取溶媒(乙醇)濃度、提取溶媒用量以及回流提取時(shí)間定為實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素備選3個(gè)水平。按照L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

圖1 混合對(duì)照品(A)、雷公藤藥材提取液(B)的HPLC圖譜

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 稱(chēng)取雷公藤藥材20g，按表2安排的試驗(yàn)進(jìn)行提取，合并2次提取液，按2.3項(xiàng)下方法制備生物堿樣品，分別測(cè)定樣品中雷公藤總生物堿、雷公藤吉堿、雷公藤次堿的提取率和干浸膏得率，雷公藤提取物的色譜圖見(jiàn)圖1(B)。試驗(yàn)結(jié)果采用綜合評(píng)分進(jìn)行評(píng)判［5］，選取雷公藤總生物堿提取率(y1)、雷公藤吉堿提取率(y2)、雷公藤次堿的提取率(y3)和干浸膏得率(y4)為考察指標(biāo)，綜合評(píng)分時(shí)指定雷公藤總生物堿提取率、雷公藤吉堿提取率、雷公藤次堿提取率、浸膏得率指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.25、0.25、0.1。規(guī)定雷公藤總生物堿提取率最高的為40分，最低的為0分，每升高1%則加5.47分［40/(19.61-12.30)］，同理雷公藤吉堿提取率每升高1%則加0.66分，雷公藤次堿提取率每升高1%則加0.97分，規(guī)定浸膏得率最低的為10分，最高的為0分，每升高1%則減去8.70分。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

以綜合評(píng)價(jià)值為考察指標(biāo)，直觀(guān)分析顯示因素作用主次為A＞C＞B＞D，方差分析結(jié)果表明因素A、C對(duì)綜合評(píng)分值具有顯著影響，根據(jù)K值，因素應(yīng)選A3B3C3D1。綜合上述分析，確定最佳工藝為，即選擇pH為4，分別用12、10倍量的80%乙醇回流提取2次，每次1h，第1次提取前浸泡1h。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，按最佳優(yōu)化條件進(jìn)行3次試驗(yàn)，分別測(cè)得雷公藤總生物堿、雷公藤吉堿、雷公藤次堿的提取率和干浸膏得率。表4結(jié)果表明該提取工藝穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表3 方差分析

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

考察中藥的提取工藝時(shí)，應(yīng)選擇能代表中藥整體的多個(gè)與功效有關(guān)的活性成分作為指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選擇雷公藤總生物堿提取率以及主要活性成分雷公藤吉堿、雷公藤次堿的提取率三項(xiàng)指標(biāo)綜合表征雷公藤生物堿的提取效率，同時(shí)兼顧浸膏得率，采用加權(quán)評(píng)分法綜合表征雷公藤生物堿的整體特性，最終通過(guò)正交試驗(yàn)確定雷公藤生物堿提取的相關(guān)工藝參數(shù)，為雷公藤生物堿的提取提供依據(jù)。

在雷公藤總生物堿提取率的考察中，采用不同對(duì)照對(duì)總生物堿含量進(jìn)行比較，最終選擇含量較高的雷公藤吉堿作為對(duì)照品，測(cè)得的結(jié)果較為穩(wěn)定，含量較高。同時(shí)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定雷公藤吉堿、雷公藤次堿的含量，在梯度洗脫條件的摸索中，考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鈉等系統(tǒng)的多種洗脫程序，結(jié)果以乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鈉可以得到良好的分離效果，2種成分的峰形對(duì)稱(chēng)，結(jié)果穩(wěn)定，可用于2種成分的定量分析。

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