錢(qián)德慧，晉軍，秦浙學(xué)，劉曦，黃嵐

表型轉(zhuǎn)化是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和新生內(nèi)膜增生的分子基礎(chǔ)[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)Krupple樣因子4(Krupple-like factor 4，KLF4)是VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[2]。血管損傷后，上調(diào)的KLF4可促進(jìn)VSMCs向合成型轉(zhuǎn)化，但KLF4本身的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚[3]。研究發(fā)現(xiàn)，非編碼小RNA(microRNA，miRNA)在VSMCs表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮了重要作用[4]，筆者利用生物信息學(xué)預(yù)分析推測(cè)KLF4可能是miRNA-29a(miR-29a)的靶基因，miR-29a在KLF4調(diào)節(jié)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化中可能扮演重要角色。本研究采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)及表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證KLF4是否為miR-29a的靶基因，進(jìn)而探討miR-29a在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用，從miRNA角度研究KLF4的部分上游調(diào)控機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 2個(gè)月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～200g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；空載體質(zhì)粒psilencer4.1-CMV、大腸埃希菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清(FBS)、DMEM/F12、G418購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熒光素酶(luciferase)報(bào)告基因系統(tǒng)購(gòu)自Ambion公司；野生型及突變型KLF4熒光素報(bào)告基因由吉?jiǎng)P基因生物公司構(gòu)建；抗大鼠KLF4、SM-MHC、SM-22α、calponin、GAPDH、β-tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；[3H]-TdR購(gòu)自重慶西南醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科。

1.2 方法

1.2.1 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死大鼠[5]，取胸腹主動(dòng)脈，剔除外膜及脂肪組織，將血管縱向剖開(kāi)刮除內(nèi)膜后剪成組織塊，用吸管將組織塊平鋪于瓶底，37℃、5%CO2孵箱干貼壁4h后，加入含20% FBS及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并添加10ng/ml PDGF。以后每3d更換培養(yǎng)液1次。

1.2.2 miR-29a靶基因驗(yàn)證 按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分為4組：野生型KLF4+miR-29a表達(dá)質(zhì)粒組、野生型KLF4+陰性表達(dá)質(zhì)粒組、突變型KLF4+miR-29a表達(dá)質(zhì)粒組和突變型KLF4+陰性表達(dá)質(zhì)粒組。具體操作為：將包含KLF4的3'-UTR區(qū)克隆至pMIRREPORTER luciferase載體編碼熒光素酶基因序列，構(gòu)建野生型KLF4熒光素報(bào)告基因；同時(shí)采用點(diǎn)突變的方法使KLF4-3'-UTR中miR-29a的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，構(gòu)建突變型KLF4熒光素報(bào)告基因。報(bào)告基因分別與miR-29a表達(dá)質(zhì)粒(psilencer4.1-CMV-mir-29a)和陰性對(duì)照質(zhì)粒(psilencer4.1-CMV-vector)用電穿孔法瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，以海腎熒光素酶作為內(nèi)參照，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性，以確定KLF4在3'-UTR區(qū)是否含有miR-29a的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)SM-MHC、SM-22α、calponin蛋白表達(dá) 將原代培養(yǎng)的VSMCs分為3組：轉(zhuǎn)染miR-29a表達(dá)質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染陰性表達(dá)質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組。分別轉(zhuǎn)染miR-29a表達(dá)質(zhì)粒、陰性表達(dá)質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(均添加10ng/ml PDGF)，48h后PBS洗滌細(xì)胞，以含PMSF裂解液冰上裂解30min。裂解后將細(xì)胞碎片和裂解液離心20min(4℃，16 000r/min)，收集上清，取其中少量測(cè)蛋白濃度，其余分裝凍存。取等量預(yù)處理的蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉-PBST室溫封閉1h。KLF4檢測(cè)：加入羊抗大鼠KLF4抗體、小鼠抗大鼠GAPDH(內(nèi)參)；VSMCs收縮表型蛋白檢測(cè)：加入羊抗大鼠SM-MHC、SM-22α、calponin抗體及小鼠抗大鼠β-tubulin(內(nèi)參)。4℃孵育過(guò)夜，再與HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG、抗鼠IgG 37℃孵育1h。按ECL發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)曝光、照相。結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參的相對(duì)表達(dá)量表示。

1.2.4 [3H]-TdR摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 分組及干預(yù)方法同1.2.3。去血清培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞6h后，加入10μl [3H]-TdR，使其終濃度為37kBq/ml。24h后吸棄培養(yǎng)液，等量PBS洗滌。0.25%胰酶500μl消化，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入小試管。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞懸液收集于玻纖濾紙上。0.9%NaCl 3ml洗滌3次后，5%三氯醋酸2ml洗2次，固定細(xì)胞；無(wú)水乙醇1ml脫水。取烘干的玻纖濾紙置入閃爍杯中，加閃爍液，暗適應(yīng)3h后上機(jī)檢測(cè)。摻入量以每孔每分鐘閃爍數(shù)(counts per min per well，cpm/well)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料以表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，三組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-29a靶基因的驗(yàn)證 與其余3組比較，共轉(zhuǎn)染野生型KLF4熒光素報(bào)告基因+miR-29a表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組中，熒光素酶活性顯著降低(圖1)，提示KLF4是接受miR-29a調(diào)控的靶基因。

2.2 miR-29a對(duì)KLF4蛋白表達(dá)的影響 體外培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)染miR-29a表達(dá)質(zhì)粒組KLF4蛋白表達(dá)水平(0.36±0.02)顯著低于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染陰性表達(dá)質(zhì)粒組(分別為1.52±0.06、1.55±0.05，P＜0.01，圖2)。

2.3 miR-29a對(duì)VSMCs收縮表型蛋白表達(dá)的影響將體外培養(yǎng)的VSMCs(添加10ng/ml PDGF)轉(zhuǎn)染miR-29a表達(dá)質(zhì)粒后48h，與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染陰性表達(dá)質(zhì)粒組相比，VSMCs收縮表型相關(guān)蛋白SM-MHC、SM-22α、calponin的表達(dá)均明顯增高(P＜0.01，圖3)。

2.4 miR-29a對(duì)VSMCs增殖能力的影響 經(jīng)[3H]-TdR摻入法檢測(cè)，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(18 145±985cpm/well)相比，轉(zhuǎn)染miR-29a表達(dá)質(zhì)粒后VSMCs的增殖能力(10 125±881cpm/well，n=6)明顯降低(P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染陰性表達(dá)質(zhì)粒組VSMCs的增殖能力(18 004±1013cpm/well)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 各組相對(duì)熒光素酶活性Fig.1 Relative luciferase activity of each group

圖2 miR-29a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)VSMCs中KLF4蛋白表達(dá)的影響(n=6)Fig.2 Effect of miR-29a plamid transfection on VSMCs KLF4 protein expression (n=6)

圖3 miR-29a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)VSMCs收縮表型相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of miR-29a plasmid transfection on expression of VSMCs contractile phenotype associated protein

3 討 論

miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性小分子、單鏈、21～22nt長(zhǎng)度的非編碼RNA[6]。miRNA對(duì)基因表達(dá)主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。其作用發(fā)揮依賴(lài)于自身“種子序列”與靶基因3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)的結(jié)合，然后經(jīng)由RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducing silence complex，RISC)來(lái)實(shí)現(xiàn)[7]。由于miRNA調(diào)控具有序列依賴(lài)性，因此結(jié)合生物信息學(xué)手段，可以預(yù)測(cè)調(diào)控KLF4的miRNAs。本研究同時(shí)采用3種預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.targetscan.org，http://www.mirbase.org/index.shtml和http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl)來(lái)預(yù)測(cè)可能調(diào)控KLF4的miRNAs，結(jié)果顯示在3種數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的miRNAs交集包括：miR-7，miR-34c，miR-32c，miR-128，miR-148/152，miR-29a，miR-29b，miR-29c。鑒于miRNA分布具有組織特異性[8]，不同的miRNA在VSMCs的表達(dá)強(qiáng)度不同，而在上述miRNA分子中，僅miR-29a在VSMCs中具有較高表達(dá)[8-9]。因此，miR-29a是最有可能在VSMCs中調(diào)控KLF4的miRNA。本研究采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型KLF4熒光素報(bào)告基因+miR-29a表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組中，熒光素酶活性顯著降低，也證實(shí)了KLF4是接受miR-29a調(diào)控的靶基因。

基于上述發(fā)現(xiàn)，我們通過(guò)進(jìn)一步轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)miR-29a上調(diào)可抑制KLF4蛋白的表達(dá)，且促進(jìn)SM-MHC、SM-22α、calponin蛋白的表達(dá)。既往研究表明，KLF4在球囊損傷側(cè)的大鼠頸動(dòng)脈后VSMCs中表達(dá)上調(diào)，而在未受損側(cè)大鼠頸動(dòng)脈VSMCs中低表達(dá)[10]。KLF4可抑制VSMCs收縮相關(guān)基因的表達(dá)，抑制其分化表型；高表達(dá)的KLF4有助于VSMCs由收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)化。KLF4調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化的可能機(jī)制是：①KLF4可通過(guò)結(jié)合VSMCs收縮相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。KLF4可結(jié)合CC(A/T-rich)GG區(qū)以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)控制元件，進(jìn)而抑制TGF-β誘導(dǎo)的收縮功能相關(guān)基因的表達(dá)。②KLF4還可抑制SRF和myocardin等轉(zhuǎn)錄因子與收縮相關(guān)基因調(diào)控序列的結(jié)合而發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。這也很好地解釋了本研究中miR-29a在抑制KLF4的同時(shí)，還可促進(jìn)VSMCs收縮表型蛋白的表達(dá)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-29a上調(diào)可降低VSMCs的增殖能力。VSMCs為非終末分化細(xì)胞，具有一定的可塑性。研究證實(shí)，多種刺激因子如細(xì)胞外基質(zhì)[11]、炎癥因子[12]、剪切力[13]、氧化產(chǎn)物、脂質(zhì)等均會(huì)啟動(dòng)VSMCs表型轉(zhuǎn)化開(kāi)關(guān)，使之呈現(xiàn)出不同的表型特征。VSMCs表型轉(zhuǎn)化主要是指其由收縮表型(contractile phenotype，亦即differentiation phenotype)向合成表型(synthetic phenotype，亦即dedifferentiation phenotype)轉(zhuǎn)化。收縮表型的VSMCs高表達(dá)收縮功能相關(guān)蛋白，如SM-MHC、SM-22α及α-calponin等[14]；合成型VSMCs低表達(dá)收縮功能相關(guān)蛋白，高表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。而向合成表型轉(zhuǎn)化是VSMCs獲得更強(qiáng)增殖和遷移能力的分子基礎(chǔ)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-29a可靶向抑制KLF4的表達(dá)，進(jìn)而維持VSMCs的收縮表型，降低其增殖能力。但miR-29a在機(jī)體生理及病理狀態(tài)的表達(dá)水平究竟如何，哪些因素在miR-29a的表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用目前仍不清楚。針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行深入探討，可為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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