趙 敏 汪開毓, 王 均, 陳德芳 黃凌遠(yuǎn), 王浩丞

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心, 雅安 625014; 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實驗室, 雅安 625014)

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)為氣單胞菌屬(Aeromonas)的一種, 亦被稱為維羅納氣單胞菌、凡隆氣單胞菌和維隆氣單胞菌, 存在于水體和淤泥等環(huán)境中[1], 能夠感染斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)[2,3]、錦鯉(Cyprinus carpio L.)[4]、西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[5]、鯡形白鮭(Coregonus clupeaformis)[6]、華鯪(Sinilabeo rendahl)[7]、框鏡鯉(Cyprinus carpio)[8]等多種魚類。其中, 斑點(diǎn)叉尾感染維氏氣單胞菌近幾年才被發(fā)現(xiàn), 其發(fā)病率可達(dá) 30%以上, 病魚死亡率在 50%以上, 給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 也嚴(yán)重制約了斑點(diǎn)叉尾養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2,9]。

目前, 在魚病的防治過程中, 養(yǎng)殖業(yè)者為減少損失,首先采用的對策就是使用抗菌藥物, 但由于水產(chǎn)病原菌日趨嚴(yán)重的耐藥性, 使得抗菌藥難以達(dá)到預(yù)期的治療效果[10—12], 從而又給魚病的防治帶來了巨大的困難。其中,四環(huán)素類藥物為一種廣譜抗生素, 通過干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成起到抑菌作用[13], 可用于防治魚類的多種細(xì)菌性疾病, 而因臨床上對該類抗生素的不合理使用, 使得魚類病原菌對此類抗生素的耐藥性變的尤為突出[10—12]。

2006—2011年, 我實驗室先后從四川地區(qū)人工養(yǎng)殖的斑點(diǎn)叉尾病樣中, 分離得到維氏氣單胞菌共 42株。本試驗以這些菌株作為研究對象, 旨在分析四川地區(qū)斑點(diǎn)叉尾源維氏氣單胞菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥狀況以及相關(guān)耐藥基因, 為臨床合理用藥以及進(jìn)一步研究維氏氣單胞菌的耐藥機(jī)制提供部分參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.2 主要試劑

藥敏紙片(四環(huán)素 30 μg/片, 強(qiáng)力霉素 30 μg/片)和MH培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司, 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-2)、2×Taq Master Mix和感受態(tài)細(xì)胞 DH5α購自天根生物科技有限公司, 克隆載體pMD19-T、DNA Marker及 DNA純化回收試劑盒購自TaKaRa公司, 氨芐青霉素鈉購自上海生工生物技術(shù)有限公司, 瓊脂糖購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司, 鹽酸四環(huán)素(98.5%)和鹽酸多西環(huán)素(98%)由四川省民生藥業(yè)有限責(zé)任公司惠贈。

1.3 菌株培養(yǎng)及藥物敏感性試驗

在無菌條件下, 取低溫保存的維氏氣單胞菌和質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922接種于MH肉湯中, 28℃恒溫?fù)u床120 r/min振蕩培養(yǎng)過夜后, 采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濁度為0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫?。然? 參照CLSI[13]推薦的紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法(藥物濃度由 128 μg/mL 2倍稀釋至0.25 μg/mL)對所有菌株進(jìn)行藥物敏感性分析; 結(jié)果參照2008年版 CLSI抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.4 tet基因片段獲得與分析

按照天根細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒(DP302-2)的操作說明提取菌體基因組DNA, –20 ℃保存?zhèn)溆?。四環(huán)素類耐藥基因的引物序列參照Nawaz, et al.[14]的報道, 詳見表 1。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。 以維氏氣單胞菌基因組DNA為模板, 分別用相應(yīng)的引物擴(kuò)增目標(biāo)基因tet A、tet B、tet C、tet D和tet E; PCR反應(yīng)體系為 50 μL: 2×Taq Master Mix 25 μL, DNA 模板 2.0 μL,上、下游引物各 1.0 μL, 無菌超純水 21 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min, 94℃ 20s, 53℃10s, 65℃ 45s共30個循環(huán), 最后 65℃延伸 4min。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物在 1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。采用DNA純化回收試劑盒回收各個基因的陽性擴(kuò)增產(chǎn)物(每個基因隨機(jī)選取其中的 5個, 不足 5個則全部回收), 相關(guān)操作參照試劑盒說明進(jìn)行。構(gòu)建pMD19-T-tet重組質(zhì)粒, 然后提取質(zhì)粒, 采用對應(yīng)引物進(jìn)行PCR鑒定, 將鑒定為陽性的質(zhì)粒送往公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列間相似性分析, 再利用 NCBI中的 Blastn系統(tǒng)進(jìn)行序列的相似性搜索, 并使用Clustal X 2.0和Mega 4.0軟件對tet基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 四環(huán)素耐藥基因擴(kuò)增引物Tab. 1 Sequences of the primers used in the study

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性測試結(jié)果

在本試驗中同時采用了紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法來測定維氏氣單胞菌的藥物敏感性, 參照吳俊偉[16]所描述的方法, 以紙片擴(kuò)散法中抑菌圈的大小作為評價維氏氣單胞菌藥物敏感性的主要依據(jù), 在進(jìn)行耐藥水平最終結(jié)果判定的時候, 對抑菌圈顯示為中介, 而 MIC值較大的菌株判定為耐藥, 對抑菌圈遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)而 MIC值偏大的菌株判定為敏感。最終得出42株維氏氣單胞菌對四環(huán)素類的藥物敏感性結(jié)果(表2、表3)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 tet基因的克隆與分析

經(jīng)測序, tetA、tetB、tetC和tetE基因片段大小分別為 211、391、891和 744 bp, 與預(yù)期結(jié)果相符。使用DNAMAN軟件分別對5個tetA、2個tetB、4個tetC和2個 tetE基因片段進(jìn)行多序列比對分析, 結(jié)果顯示其一致性均為100%。然后將上述4類基因片段序列在NCBI中的 Blastn系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析, 結(jié)果顯示: tetA、tetB、tetC和tetE基因片段分別與GenBank中登陸的多個tet基因的同源性為100%。

圖1 tetA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of tetA gene

圖2 tetB基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of tetB gene

在GenBank中分別下載多個tet A、tet B、tet C和tet E基因用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1-4)。結(jié)果顯示tetA基因與存在于點(diǎn)狀氣單胞菌(Aeromonas punctata)pFBAOT6質(zhì)粒(GenBank登錄號: 51492513)中的tetA基因, 大腸桿菌O69 (Escherichia coli serotype O69)質(zhì)粒介導(dǎo)的tetA基因(GeneBank登錄號: 227434002)、大腸桿菌Q19中的tetA基因(GeneBank登錄號: 393195318)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)pKPI-6質(zhì)粒(GenBank登錄號:394557614)中的tetA基因、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)中的 tetA基因(GenBank登錄號: 242277425)聚為一簇;tetB基因與來自福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)中質(zhì)粒介導(dǎo)的 tetB基因(GenBank登錄號: 12054718)、大腸桿菌pTC1質(zhì)粒中的tetB基因(GenBank登錄號: CP000913.1)、多殺巴斯的桿菌(Pasteurella multocida)中的 tetB基因(GenBank登錄號分別為: 336087901、EU252517.1)、沙門氏菌(Salmonella enterica)質(zhì)粒介導(dǎo)的 tetB基因(GenBank登錄號:353467616、HQ331538.1)等聚為一簇;tetC基因與大腸桿菌中的 tetC基因(GenBank登錄號分別為: 190887129、190887131、190887127、190887125)、沙門氏菌中的tetC基因(GenBank登錄號: GU987054.1)以及plPO2T質(zhì)粒中的 tetC基因(GenBank登錄號:21735067)聚為一簇; tetE基因則與來自殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)中的 tetE基因(GenBank登錄號分別為: 113129387、145301211)聚為一簇。

3 討論

在本研究中, 采用了紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法對 42株維氏氣單胞菌進(jìn)行了藥物敏感性測試, 兩種方法所得出的結(jié)果并不完全一致, 為了能夠確定最終的結(jié)果, 因此參考吳俊偉[15]所提出的方法, 以紙片擴(kuò)散法中抑菌圈的大小作為評價菌株耐藥性的主要依據(jù), 參考MIC值進(jìn)行評判, 對抑菌圈中介, 而MIC值較大的菌株判定為耐藥, 對抑菌圈遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)而MIC值偏大的菌株判定為敏感。最終得出受試菌株對四環(huán)素耐藥的共有28株, 耐藥率為66.67%; 對強(qiáng)力霉素耐藥的共有24株, 耐藥率為57.14%,明顯低于四環(huán)素。但從敏感菌株來看,對四環(huán)素和強(qiáng)力霉素敏感的菌株均為10株, 敏感率為23.80%, 兩者沒有差別, 這說明了四川地區(qū)的維氏氣單胞菌對于四環(huán)素和強(qiáng)力霉素的耐藥性已經(jīng)達(dá)到了非常嚴(yán)重的水平。

在革蘭氏陰性菌中, 細(xì)菌對四環(huán)素類藥物的耐藥機(jī)制主要有兩種, 一種是核糖體保護(hù)蛋白, 該蛋白能保護(hù)核糖體免受四環(huán)素類藥物的作用從而產(chǎn)生耐藥[16]; 另一種是主動外排作用, 通過外排蛋白將四環(huán)素排出胞外,細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度因此降低, 核糖體因此受到保護(hù), 從而產(chǎn)生了耐藥性, 這是最早被研究的一種耐藥機(jī)制[17],也是本研究中被證明存在于維氏氣單胞菌中的一種耐藥機(jī)制。外排蛋白屬于主要異化超家族(Major facilitatorsuperfamily, MFS)中的一員[18]。目前, 已有超過 20種不同的四環(huán)素外排蛋白被發(fā)現(xiàn), 這些蛋白被分為 6個不同的類群[17], tetA、tetB、tetC、tetD和tetE基因所編碼的外排蛋白屬于該6個類群中的第1類群[19], 均發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陰性菌中[17,19]; 該類群蛋白具有12個跨膜α-螺旋, 其四環(huán)素抗性蛋白具有 41%—78%的氨基酸同源性, 而它們的四環(huán)素阻抑蛋白具有 37%—88%的氨基酸同源性[20]。在氣單胞菌中, tetA、tetB、tetC、tetD和tetE基因已經(jīng)先后被證實存在于該屬中, 并且發(fā)現(xiàn)tetE基因在該5種耐藥基因中檢出率最高[21—24], 說明該基因是介導(dǎo)氣單胞菌分離株對四環(huán)素類藥物耐藥的優(yōu)勢基因。Nawaz, et al.[14]對分離自鯰魚的 81株耐四環(huán)素的維氏氣單胞菌進(jìn)行了相關(guān)研究, 發(fā)現(xiàn)tetA、tetB、tetC、tetD和 tetE檢出率分別為 3.70%(3/81)、28.40%(23/81)、2.47%(2/81)、2.47%(2/81)、90.12%(73/81), 其中 tetE基因的檢出率顯著高于其他 4個基因, 為其優(yōu)勢基因, 符合上述觀點(diǎn)。然而,Jacobs, et al.[25]在對37株分離自南非水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的氣單胞菌的研究中, 以及 Kim, et al.[26]對8株分離自韓國的耐四環(huán)素殺鮭氣單胞菌的研究中都發(fā)現(xiàn)tetA基因在這些菌株中檢出率最高。在本研究中, 同樣發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥的菌株 tetA基因檢出率最高, 且明顯高于其他 4個基因, 而 tetE基因僅在 2株菌中被檢測到, 與最初的研究結(jié)果存在差異; 這說明在維氏氣單胞菌中, 四環(huán)素類耐藥基因的流行存在地域性差異。

表2 42株維氏氣單胞菌對四環(huán)素類抗生素的敏感性試驗結(jié)果Tab. 2 Susceptibility to tetracycline antibiotics of 42 Aeromonas veronii strains

圖3 tetC基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of tetC gene

圖4 tetE基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of tetE gene

同時, 本研究還發(fā)現(xiàn)在 16和 29號菌株中同時檢測到tetA和tetC, 在8號菌株中同時檢測到tetA、tetB和tetC; 關(guān)于一株菌中同時檢測出幾種四環(huán)素類耐藥基因的情況, 在Nawaz, et al.[15], Schmidt, et al.[23]以及 ?í?ek A, et al.[25]各自的研究中已有報道。此外, 我們的研究還發(fā)現(xiàn)在耐藥菌株4、10、12中并未檢測到上述5種耐藥基因, 說明在維氏氣單胞菌中可能還存在其他的四環(huán)素耐藥機(jī)制, 有待進(jìn)一步研究。

表3 42株維氏氣單胞菌對四環(huán)素類抗生素的敏感性試驗結(jié)果Tab. 3 Susceptibility to tetracycline antibiotics of 42 Aeromonas veronii strains

表4 各基因的檢出率Tab. 4 The positive rate of the gene

在本研究中, 首次在國內(nèi)維氏氣單胞菌分離株中檢測到tetA、tetB、tetC和tetE基因, 為進(jìn)一步研究我國境內(nèi)的維氏氣單胞菌的耐藥機(jī)制提供了一定的理論依據(jù);同時, 本研究的結(jié)果也突出了目前我國水產(chǎn)病原菌耐藥性的嚴(yán)重性。因此, 如何防止水產(chǎn)病原菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播, 以及在魚病的防治過程中如何應(yīng)對因病原菌耐藥性而造成的困難值得廣大學(xué)者共同關(guān)注。