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        興國紅鯉MHCⅡ類α基因多態(tài)性、表達及其與魚體抗病力關系的分析

        2014-05-27 08:08:38劉至治王成輝項松平
        水生生物學報 2014年2期
        關鍵詞:興國水氣抗病

        劉 俊 劉至治 王成輝 項松平 王 劍

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        興國紅鯉MHCⅡ類α基因多態(tài)性、表達及其與魚體抗病力關系的分析

        劉 俊1劉至治1王成輝2項松平3王 劍3

        (1. 上海海洋大學水產(chǎn)種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質資源重點實驗室, 上海 201306; 3. 浙江龍泉省級甌江彩鯉良種場, 龍泉 323700)

        對41尾感病和22尾抗病興國紅鯉的308個有效克隆進行測序, 獲得171條不同的MHC Ⅱ類α基因編碼序列, 分屬26個不同的等位基因, 其中Cyca-DXA24—Cyca-DXA36為新發(fā)現(xiàn)的13個等位基因。MHCⅡ類α基因片段的長度為624 bp, 包括第1—4個外顯子, 分別編碼信號肽、α1和α2結構域及連接肽/跨膜區(qū)。α1結構域的變異明顯大于α2結構域, 表現(xiàn)在α1結構域中核苷酸和氨基酸變異位點比例(55.16%和79.76%)明顯高于α2結構域的變異位點比例(45.96%和68.42%)。α1結構域的PBR區(qū)的非同義堿基替換率(N)與同義堿基替換率(S)的比值(=N/S)為5.742, 遠遠高于非抗原結合位點(non-PBR)及α2結構域的0.755、0.592, 揭示興國紅鯉MHC Ⅱ類α基因的α1結構域在進化過程中受到正向選擇作用。等位基因Cyca-DXA24 (<0.01)與興國紅鯉對嗜水氣單胞菌的抗性相關, 等位基因Cyca-DXA3 (<0.05)、Cyca-DXA4 (<0.01)、Cyca-DXA6 (<0.05)、Cyca-DXA33 (<0.05)與興國紅鯉對嗜水氣單胞菌的易感性相關。熒光定量PCR結果表明, MHCⅡ類α基因在健康興國紅鯉的腎、肝、鰓等10個組織均能普遍表達。人工感染嗜水氣單胞菌后, 腎、肝、脾3個組織中的MHCⅡ類α基因的表達量均發(fā)生了不同程度的變化, 表明MHCⅡ類α分子在興國紅鯉的免疫反應中起到重要作用。

        興國紅鯉; MHC; 多態(tài)性; 表達; 抗病力

        興國紅鯉(var.)為“江西三紅”之一, 其分布于江西省興國縣, 已有1300余年的養(yǎng)殖歷史[1]。據(jù)報道, 從1972—1984 年, 相關單位已對其進行了6代定向選育, 培育出性狀穩(wěn)定的品種[2], 目前已選育至20代。興國紅鯉是重要的雜交親本, 在我國魚類雜交育種中具有重要作用。

        在淡水養(yǎng)殖中, 嗜水氣單胞菌為主要病原菌之一, 目前沒有針對該菌的有效疫苗[3, 4]。因此, 有必要從綠色水產(chǎn)的角度出發(fā), 努力尋找一種安全的新方法, 增加魚體對嗜水氣單胞菌等病原菌的抵抗力。研究證明, 主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex, MHC)在魚類機體的免疫中發(fā)揮著極為重要的作用, 與許多疾病的抗性、易感性、免疫應答都密切相關, 已成為抗病力相關研究的重要候選基因[5—8]。本研究以興國紅鯉為對象, 人工感染嗜水氣單胞菌后, 分析MHCⅡ類α基因序列多態(tài)性與抗病力之間的關系, 同時采用熒光定量PCR技術, 檢測健康魚體不同組織中MHCⅡ類α基因mRNA表達水平上的差異性, 并分析魚體感染嗜水氣單胞菌后, MHCⅡ類α基因在腎、肝、脾等組織中mRNA水平的變化。研究結果將為興國紅鯉抗病基因的篩選及抗病育種提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        2010年10月從江西省興國紅鯉良種場引入2 齡興國紅鯉, 養(yǎng)殖于浙江省龍泉省級甌江彩鯉良種場。2011年8月, 隨機選取健康魚(體重約601 g), 腹腔注射嗜水氣單胞菌(由上海海洋大學國家水生動物病原庫提供)進行人工感染。具體方法: 實驗組魚63尾, 每尾每100 g體重注射0.1 mL濃度為1.5×109cfu/mL的嗜水氣單胞菌; 對照組魚15尾, 每尾則注射相應量的磷酸生理鹽水。13h后實驗組魚開始死亡, 而對照組魚在整個實驗過程中生長正常, 無任何生病或死亡癥狀。這里, 感染96h后不出現(xiàn)發(fā)病癥狀的個體為抗病個體, 而96h內出現(xiàn)口鰓出血、體表出血、皮膚潰瘍、游動遲緩等癥狀且直至臨死的個體為感病個體。最終, 共得到41尾感病和22尾抗病個體。在感染過程中, 隨著感病個體的死亡, 及時取腎、肝、脾等組織, 迅速放入液氮中凍存, 轉至?80℃冰箱備用; 而抗病個體的相關組織, 則在感染完畢后采集。

        1.2 方法

        總RNA的提取和cDNA的合成 Trizol法提取實驗魚腎中的總RNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 分光光度計測定RNA濃度及OD值, 要求在1.8—2.0。以總RNA為模板, 利用反轉錄試劑盒PrimeScript First Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)合成cDNA。

        引物設計, PCR擴增, 產(chǎn)物的純化、克隆及測序 根據(jù)van Erp[9]已獲得的鯉MHCⅡ類α基因(GenBank登錄號為X95432), 設計一對特異性引物: DXAF (5′-TGCTTATGCTCGCTCTTATTGTC-3′)和DXAR (5′-ACCCACTCCACAAAACACAGCTG-3′) (由上海生工生物工程服務有限公司合成), 用于擴增荷包紅鯉MHCⅡ類α基因的片段。PCR反應總體積為25 μL, 包括: 1.0 μL cDNA (100 ng), 1.0 μL上、下游引物 (10 μmol/L), 2.0 μL dNTP Mixture (2.5 mmol/mL), 2.5 μL 10×Buffer, 0.6 μLDNA聚合酶(Tiangen, 5 U/μL), 16.9 μL去離子水。PCR 程序如下: 94℃預變性3min; 94℃1min、54℃1min、72℃2min, 35 個循環(huán); 72℃延伸10min。所有PCR 反應均在Mastercycler ep gradient S (Eppendorf)型PCR儀上進行。

        參照文獻[10]的方法, 進行PCR產(chǎn)物的純化、目的片斷的連接和轉化、陽性克隆的鑒定等操作。每尾個體隨機挑選5個陽性克隆, 由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的ABI3730測序儀測序。

        實時熒光定量 PCR 分別在人工感染后12、24、48、72和96h 隨機選取3尾興國紅鯉, 取其腎、肝和脾組織, 以及對照組魚的10個組織(腦、眼、鰓、心臟、腸、腎、肝、肌肉、脾和胃)。提取各組織RNA, 選取高質量且等量的RNA, 根據(jù)Prime ScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time) (TaKaRa)試劑盒附帶的說明書, 進行反轉錄實驗制備cDNA模板。PCR 反應體系: 5× PrimeScript RT Master Mix 2 μL、500 ng RNA 最后加RNase Free dH2O 至10 μL。反應條件: 37℃ 15min, 85℃ 5s, 4℃保存。

        實時熒光定量PCR使用SYBR Premix ExTMⅡ(Perfect Real Time) (TaKaRa)試劑盒, 反應擴增引物為DXA-ex-F (5′-AGGTGATGTGGTGCTGGGTG-3′)和DXA-ex-R (5′-AGCGAGGAGAAGATGTTGAAGG-3′), 產(chǎn)物長度為171 bp。20 μL PCR 反應體系為: 2 μL cDNA、10 μL SYBR Premix ExTMⅡ、0.4 μL ROXⅡ、0.8 μL上下游引物(10 μmol /L)和6.0 μL ddH2O。PCR 擴增條件為: 95℃預變性30s; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 40個循環(huán); 60—95℃ 15min進行溶解曲線檢測。每個樣本3個重復, 空白對照采用ddH2O作為模板。目的基因的標準曲線以腎組織的cDNA 10 倍系列(1.0 × 10–1、1.0 ×10–2、1.0 ×10–3、1.0 ×10–4、1.0 ×10–5倍)稀釋為模板得到, 通過標準曲線來檢測實時熒光定量PCR引物的特異性和試驗的可靠性。反應在7500實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進行。每個目的基因的相對表達以內參β-actin為參考基因, 引物序列: β-actin-ex-F (5′-TGCTATGTGGCTCTTGA- CTT-3′)和β-actin-ex-R (5′-CTGGGCACCTGAACCT- CT-3′), 產(chǎn)物長度為127 bp。數(shù)據(jù)由7500PCR 儀自帶的軟件分析得到, 數(shù)據(jù)處理采用2–△△Ct法[11]。

        MHCⅡ類α基因的命名與數(shù)據(jù)分析 已知鯉MHCⅡα有MHC-DXA一種基因型, 故興國紅鯉MHCⅡ類α基因的命名參照文獻[10]中的方法進行。

        登錄NCBI, 用BLAST對所獲得的序列進行同源檢索, 確定所得的基因片段。用Clustal X[12]對蛋白質序列進行多序列比對。利用MEGA 4.0[13]分析核苷酸序列和氨基酸序列的變異位點, 確定等位基因, 計算核苷酸的錯義和同義替換率、氨基酸的組成比例; 參照人類HLAⅡ類分子的晶體三維結構[14], 對獲得的興國紅鯉MHCⅡ類基因序列的α1結構域的抗原結合位點(PBR)進行界定, 然后用MEGA 4.0軟件中改進的Nei-Gojobori (Jukes-Cantor)方法, 計算非同義堿基替換率(N)和同義堿基替換率(S)的比值(=N/S)。利用DnaSP 5.0[15]進行第二外顯子和第三外顯子序列的多態(tài)性分析。

        2 結果

        2.1 興國紅鯉MHCⅡ類α基因序列測定

        本研究對63尾興國紅鯉的308個有效克隆進行了測序與分析。所得序列經(jīng)NCBI中BLAST同源比對, 確認為MHCⅡ類α基因片段。序列經(jīng)對位排列和變異檢測后, 沒有發(fā)現(xiàn)任何插入、缺失或異常的密碼子。該核苷酸序列長度為624 bp, 編碼11個氨基酸的部分信號肽、84個氨基酸的完整α1結構域、95個氨基酸的完整α2結構域和18個氨基酸的完整連接肽及部分跨膜區(qū), 共208個氨基酸。推斷的氨基酸序列經(jīng)比對后, 分屬26個不同的等位基因, 其中有13個等位基因為新發(fā)現(xiàn)的等位基因, 命名為Cyca-DXA24*01—Cyca-DAB36*01 (GenBank登陸號為KF154087-KF154099)。

        2.2 興國紅鯉MHCⅡ類α基因多態(tài)性

        分析表明, 興國紅鯉MHCⅡ類α的26個等位基因所包含的亞型數(shù)量多少不均。如等位基因Cyca-DXA24含有47個亞型, 頻率高達40.58%; 而Cyca-DXA19的亞型僅有1個, 頻率為0.32%。此外, 各亞型的出現(xiàn)頻率高低不一。在總共171個亞型中, Cyca-DXA24*01出現(xiàn)的頻率最高, 為24.03%, 其次是Cyca-DXA4*01 (4.87%), 其余大多數(shù)亞型僅出現(xiàn)一次(0.32%)。值得注意的是, 我們發(fā)現(xiàn)單一個體中最多存在5個等位基因, 表明興國紅鯉個體中至少存在3個DXA基因座。

        在所得的MHCⅡ類α基因核苷酸序列中, 分別檢測到297個核苷酸變異位點和197個簡約信息位點。MHCⅡ類α基因的核苷酸變異位點比例為47.60%(297/624), 而氨基酸相對應的值則高達69.23% (144/208) (表1)。MHCⅡα序列間的堿基及氨基酸變異范圍分別為0—9.6%和0—16.8%, 平均值為5.3%和9.5%。此外, α1結構域的核苷酸/氨基酸位點變異率為55.16%/79.76%, 明顯大于α2結構域的45.96%/68.42% (表1)。MHCⅡ類α 的信號肽、CP及TM變異都不大, 屬于保守序列。對全部序列的分析表明, 興國紅鯉MHCⅡ類α基因的單倍型多樣度(H)、核苷酸多樣度(P)及平均核苷酸差異數(shù)目()分別是0.9831、0.05332、33.275。

        分析表明(表2), 在含有21個氨基酸位點的PBR區(qū)中, 變異位點數(shù)高達20個(95.24%), 而在non-PBR區(qū)的63個位點中, 變異位點數(shù)卻只有46個(73.01%), PBR區(qū)的變異率明顯高于non-PBR。計算表明, α1結構域的PBR區(qū)的值為5.742遠大于1, 而它們的non-PBR區(qū)(0.755)和α2結構域(0.592)的值卻都小于1, 表明興國紅鯉MHCⅡα基因(尤其是α1結構域)在進化過程中受到正向選擇(Positive selection)作用。

        2.3 興國紅鯉MHCⅡ類α基因與抗病力的關系

        在所得的26個不同的MHCⅡ類α基因中(圖1), 其中有11個等位基因在感病群體和抗病群體中都出現(xiàn), 剩余的Cyca-DXA3、Cyca-DXA5、Cyca- DXA8、Cyca-DXA10、Cyca-DXA17、 Cyca-DXA19、Cyca-DXA20、Cyca-DXA22、Cyca-DXA30—Cyca- DXA36等15個等位基因則為感病群體所特有, 沒有發(fā)現(xiàn)只存在于抗病群體的等位基因。等位基因Cyca-DXA3、Cyca-DXA33的頻率為9.00%和5.00%,顯著存在于感病群體中(<0.05); 等位基因Cyca- DXA4、Cyca-DXA6在感病群體中出現(xiàn)的頻率(27.00%、6.50%), 分別極顯著(<0.01)和顯著(<0.05)地高于抗病群體中出現(xiàn)的頻率(3.70%、0.93%); 等位基因Cyca-DXA24在抗病群體中出現(xiàn)的頻率(81.48%)極顯著(<0.01)高于感病群體中出現(xiàn)的頻率(18.50%)。

        表 1 興國紅鯉核苷酸和氨基酸的變異位點

        表2 興國紅鯉MHCⅡ類基因α1結構域的PBR、non-PBR及α2結構域的dS和dN值

        圖 1 不同等位基因在抗病群體與感病群體的分布頻率(%)

        **< 0.01;*< 0.05

        2.4 興國紅鯉MHCⅡ類α基因mRNA在組織中的表達

        以興國紅鯉的腎cDNA為模板, 將模板做10倍梯度稀釋, 通過引物β-actin-ex-F、β-actin-ex-R 和DXA-ex-F、DXA-ex-R 進行實時熒光定量PCR, 制作內參基因和目的基因的標準曲線。經(jīng)優(yōu)化, β-actin和MHCⅡ類α基因的擴增效率分別為95.15%和96.18%, 標準曲線的相關系數(shù)都為1, 斜率分別為–3.444和–3.417, 表明可以用2–△△法進行相對定量分析。溶解曲線中沒有雜峰出現(xiàn), 未出現(xiàn)非特異性擴增, 試驗條件達到實驗要求, 可靠性較高。

        通過實時熒光定量PCR技術的分析結果表明, 興國紅鯉的10 個組織中均擴增出MHCⅡ類α 基因目的片段, 但表達量有所不同, 其中較強表達于腎、肝、鰓、腸、脾, 中等強度表達于心臟、胃、腦, 而在眼和肌肉中表達較弱(圖2A)。

        人工感染嗜水氣單胞菌后的不同時期, 興國紅鯉腎、肝、脾這三個組織中的MHCⅡ類α 基因表達水平均發(fā)生了不同程度的變化(圖2B)。在腎組織中, MHCⅡ類α基因表達水平在12h表達水平最高, 接著發(fā)生下降, 在72h表達量最低, 呈先上升后下降的變化趨勢。在肝和脾組織中, MHCⅡ類α基因表達水平都是先下降后上升的趨勢, 96h之后恢復到原來的水平, 只是肝、脾組織中最低表達水平分別在感染后48h和24h。

        圖 2 MHCⅡ類α 基因在健康(A)和感染(B)后興國紅鯉的各組織中的相對表達量

        3 討論

        MHC 是基因組中多態(tài)性最豐富的區(qū)域之一, 這主要表現(xiàn)為多基因座及每個基因座含有相當數(shù)量的等位基因[10]。本研究發(fā)現(xiàn)每尾魚體中存在1—5個等位基因, 表明興國紅鯉MHCⅡ類α基因至少含有3個基因座。這一結果與條紋鱸()[16]、大菱鲆()[17]、牙鲆()[18]等的研究結果不同, 這些魚類的個體中含有MHCⅡ類等位基因的數(shù)量最多不超過4個, 推測至少含有2個基因座。而對于同是鯉的全紅體色甌江彩鯉(var.), 李雪松等[8]的報道推測單個個體中也是至少含有2個基因座??梢? 魚類物種間含有MHC等位基因座的數(shù)量, 僅靠測序還無法確定, 需要設計核酸探針進行原位雜交來驗證。關于魚類MHCⅡ類α基因多態(tài)性的研究已有不少報道。Stet,.[19]從84尾大西洋鮭個體中檢測到7個等位基因; 徐田軍和陳松林[20]從45尾牙鲆個體得到129條序列, 共編碼30個等位基因; Pang,.[21]從6尾尼羅羅非魚()個體檢測到10個等位基因。本實驗從63尾興國紅鯉中共得到26個不同的等位基因, 雖較牙鲆、尼羅羅非魚的多態(tài)性低, 卻遠遠高于大西洋鮭。不同魚類MHCⅡ類α基因的多態(tài)性高與低, 可能是該物種的故有特征, 或者是跟它們的生長進化史有關, 如奠基者效應、基因漂流、基因選擇等。

        MHC是一個與抗病相關的基因家族, 不同的等位基因可能具有不同的抗病能力。作為抗病相關的分子標記候選基因, MHC已經(jīng)被國內外學者越來越多地應用于各種海、淡水魚類的抗病輔助育種的研究中。有關于MHCⅡ類α 基因與魚體抗病力之間關系的研究, 多集中于牙鲆[18]與大西洋鮭[26, 27]。Xu,.[18]在研究牙鲆MHCⅡ類α基因與鰻弧菌()抗病力的關系時, 發(fā)現(xiàn)Paol-DAA* 1301、Paol-DAA*1401、Paol-DAA*2201與抗病性相關, Paol-DAA*1001、Paol-DAA*1501與感病性相關; Kj?glum,.[26]研究MHCⅠ類和MHCⅡ類聯(lián)合基因型與大西洋鮭癤病(Furunculosis)的抗病性的關系, 發(fā)現(xiàn)含有DAA*0301的魚抵抗力顯著強于DAA*0201的魚; Wynne,.[27]發(fā)現(xiàn), 含有Sasa-DAA-3'UTR中單倍型239/259和259/259的大西洋鮭, 對阿米巴鰓病的感染度明顯低于其他不含有該單倍性的個體。本研究在探討興國紅鯉MHCⅡ類α 基因與嗜水氣單胞菌抗性的相關性時, 獲得了5個與魚體抗病力相關的等位基因, 其中Cyca- DXA3、Cyca-DXA4、Cyca-DXA6、Cyca-DXA33與興國紅鯉對嗜水氣單胞菌的易感性相關, 而Cyca- DXA24則與抗病性相關。雖然不能排除會有另外的連鎖基因可能導致本研究的結果, 但它們?yōu)楹Y選抗病相關MHCⅡ類α 基因標記提供了重要的參考依據(jù)。

        許多研究表明, 不同魚類的MHCⅡ類α基因的mRNA表達水平存在組織特異性。Srisapoome,.[28]檢測牙鲆的MHCⅡ類α基因在鰓、脾、腎、腸、胃中表達較高, 在肌肉和眼中表達較低; Li,.[29]的研究顯示, 在健康的圓斑星鰈()的腎、鰓、脾中表達量最高, 在肝、心臟和皮膚中度表達, 在肌肉和腦中表達量最低。在本研究中, 興國紅鯉MHCⅡ類α基因的表達特異性, 與上述研究結果基本相符。腎和脾是最重要的免疫器官, 肝和黏膜上皮組織等也是重要的免疫防線, 而肌肉組織的免疫功能則是較低的??梢? 魚類MHCⅡ類α基因在不同組織中表達量的高低與其免疫細胞的分布有關, 揭示腎、肝、鰓、脾、腸等在魚類免疫過程中起重要作用。

        致謝:

        在感染實驗及樣品采集過程中, 本院研究生畢祥、李雪松、趙雪錦、朱麗艷、胡建尊等同學提供了很多幫助, 在此表示衷心感謝。

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        THE ANALYSIS OF THE POLYMORPHISM AND EXPRESSION OF MHC CLASSGENE AND ITS ASSOCIATION WITH RESISTANCE/SUSCEPTIBILITY TOIN XINGGUO RED COMMON CARP

        LIU Jun1, LIU Zhi-Zhi1, WANG Cheng-Hui2, XIANG Song-Ping3and WANG Jian3

        (1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Agriculture, Shanghai 201306, China; 3. Oujiang Color Common Carp Provincial Farm, Longquan 323700, China)

        We cloned 171 sequences of MHC class IIα gene were determined from 41 susceptible and 22 resistant individuals ofvar.. These sequences belonged to 26 alleles, thirteen of which were novel (Cyca-DXA24-Cyca-DXA36). The total length of the sequence was 624 bp, consisting of a 33 bp exon1, a 252 bp exon2, a 285 bp exon3, and a 54 bp exon4. These exons encoded a partial signal peptide, a α1 domain, a α2 domain and a connecting peptide (CP)/partial transmembrane (TM), respectively. The mutation-Prone positions of nucleotide or amino acid sites in α1 domain (55.16%, 79.76%) significantly out number than those in α2 domain (45.96%, 68.42%). Thevalues (=N/S) were 5.742 for peptide-binding region (PBR), 0.755 for non-PBR in the α1 domain and 0.592 for the α2 domain, implying that the positive selection pressure probably had occurred in the PBR region of the α1 domain. Cyca-DXA24 (<0.01) was significantly correlated with the carp’s resistance to, while Cyca-DXA3 (<0.05), Cyca-DXA4 (<0.01), Cyca-DXA6 (<0.05) and Cyca-DXA33 (<0.05) alleles were significantly associated with the fish’s susceptibility to the disease. Real-time quantitative PCR demonstrated that MHC IIα genes were ubiquitously expressed in ten tissues. The expression was up-regulated in kidney, down-regulated in liver and spleen during infection. Our results indicated that the MHC class IIα gene might play an important role in the immune reactions ofvar..

        var.; MHC; Polymorphism; Expression; Disease resistance

        2013-08-09;

        2013-11-02

        農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(200903045); 上海市教育委員會科研創(chuàng)新基金(11YZ152); 上海高校水產(chǎn)一流學科建設項目資助

        劉俊(1987—), 女, 河南信陽人; 碩士研究生; 研究方向為魚類分子進化與免疫遺傳學。E-mail: liujunhnsd@126.com

        劉至治, E-mail: zzliu@shou.edu.cn; 王成輝, E-mail: wangch@shou.edu.cn

        Q346+.5

        A

        1000-3207(2014)02-0241-08

        10.7541/2014.36

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