江蘇省泰州市中醫(yī)院（225300）王威 王姝梅 朱春健

萬古霉素（Vancomycin）是糖肽類抗生素，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，臨床上主要用于嚴(yán)重的革蘭陽性菌感染，特別是耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(MRSE)所致的感染[1]。但萬古霉素的治療指數(shù)窄，個(gè)體差異大，影響因素多，且具有一定的耳腎毒性[2]，因此對(duì)患者進(jìn)行萬古霉素的血藥濃度監(jiān)測(cè)尤為重要。

隨著分析儀器與分析方法的不斷發(fā)展，萬古霉素血藥濃度的測(cè)定方法也由探索轉(zhuǎn)為規(guī)范。有研究報(bào)道，熒光偏振免疫法及高效液相色譜法是目前常用的萬古霉素血藥濃度測(cè)定方法[3]。本研究采用反相高效液相色譜法測(cè)定了萬古霉素的血藥濃度，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 資料和方法

1.1 藥品與試劑 萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），磷酸氫二鉀（分析純），磷酸（分析純），硫酸鋅（分析純），乙腈（色譜純），空白血漿（泰州中醫(yī)院輸血科），水為超純水。

1.2 儀器日本島津HPLC儀，LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測(cè)器，LC-SOLUTION工作站；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.3 色譜條件 色譜柱：ODS-C18柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.0125moL?L-1磷酸二氫鉀緩沖液（8 ∶ 92，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：236nm；流速：1.0 mL?min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 精密稱取萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品12.50mg加超純水溶解并于25mL量瓶中定容，配成質(zhì)量濃度為500 mg?L-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，置冰箱4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 流動(dòng)相的配置 取磷酸二氫鉀1.70g加超純水溶解并于1000mL量瓶中定容，磷酸調(diào)pH至3.2，配成0.0125 moL?L-1的磷酸二氫鉀緩沖液；取乙腈460mL，磷酸二氫鉀緩沖液40mL，混合超聲30min。

1.6 10 %硫酸鋅溶液的配置 精密稱取硫酸鋅5.0 g加超純水溶解并于50mL量瓶中定容，配制成10%硫酸鋅溶液，0.22μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 血樣處理 取200μL空白血漿，加入50μL 10%硫酸鋅，旋渦混勻，12000r?min-1離心4min，取上清液10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 分別取空白血漿100μL、空白血漿100μL加一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、病人用藥后血漿100μL，按“1.7”項(xiàng)下方法處理，并按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)繪HPLC圖譜，色譜圖見附圖。結(jié)果表明，血漿中成分不干擾萬古霉素的測(cè)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用超純水分別稀釋成濃度為5，10，20，40，100，200，400mg?L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取空白血漿100μL置于帶塞離心管中，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，混勻，使萬古霉素的濃度分別為2.5，5，10，20，50，100，200mg?L-1。按“1.7”項(xiàng)下方法處理，并按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)繪HPLC圖譜，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以萬古霉素進(jìn)樣濃度（X，mg?L-1）為橫坐標(biāo)，采用加權(quán)(1/C2)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程Y=9065.1 X - 235.46（r=0.9997， n=7）。結(jié)果表明萬古霉素進(jìn)樣濃度在2.5～200 mg?L-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

附圖 萬古霉素（1）的血漿樣品色譜圖

2.3 精密度測(cè)定 分別取空白血漿100μL，加入低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，混勻，使萬古霉素濃度分別為2.5 mg?L-1，50 mg?L-1，200 mg?L-1，按血樣處理和測(cè)定方法操作，以1天內(nèi)每個(gè)濃度5個(gè)樣品測(cè)定的萬古霉素濃度計(jì)算日內(nèi)精密度，以一周內(nèi)連續(xù)3天測(cè)定的萬古霉素濃度計(jì)算日間精密度。結(jié)果低、中、高3個(gè)濃度日內(nèi)RSD分別為3.91%，2.38%，1.77%，日間RSD分別為4.01%，2.35%，1.82%。

2.4 回收率試驗(yàn) 取空白血漿100μL，分別加入低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，混勻，使萬古霉素濃度分別為2.5mg?L-1，50mg?L-1，200 mg?L-1，每個(gè)濃度各配置5個(gè)樣品，按血樣處理和測(cè)定方法操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出萬古霉素的濃度，并按照公式計(jì)算回收率：回收率（%）=測(cè)得值/加入值×100%。結(jié)果低、中、高濃度的相對(duì)回收率分別為99.4%，100.3%和99.2%，RSD分別為2.9%，3.2%，1.8%（n=5）。

2.5 穩(wěn)定性考察 取空白血漿100μL，分別加入低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，混勻，使萬古霉素濃度分別為2.5 mg?L-1，50 mg?L-1，200 mg?L-1，每個(gè)濃度各配置3個(gè)樣品，室溫放置，于0、1、2、4、6、8、24h，按血樣處理和測(cè)定方法操作，測(cè)定萬古霉素的濃度。結(jié)果低、中、高濃度的萬古霉素峰面積積分值RSD分別為1.47%，1.57%和1.12%，表明萬古霉素血漿樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

本研究分別考察了磷酸二氫鉀溶液-乙腈體系、磷酸二氫鉀溶液-甲醇體系以及磷酸二氫鉀溶液-乙腈-甲醇體系作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)萬古霉素色譜行為的影響，結(jié)果表明，磷酸二氫鉀溶液-甲醇體系下，色譜峰寬大且分離效果不佳；文獻(xiàn)中常用流動(dòng)相“磷酸二氫鉀溶液-乙腈-甲醇體系”配備復(fù)雜，重現(xiàn)性較差；磷酸二氫鉀溶液-乙腈體系下能夠得到較滿意的色譜峰。因此本研究最終采用乙腈-0.0125moL?L-1磷酸二氫鉀緩沖液（8∶92，V/V）作為流動(dòng)相。

通過研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用磷酸二氫鉀緩沖體系能夠一定程度低改善峰形，但緩沖液濃度過大時(shí)會(huì)造成鹽析，導(dǎo)致柱壓升高，從而影響分離效果。本研究考察了0.0125moL?L-1磷酸二氫鉀緩沖液pH值分別為4.5、3.6、3.2、3.0時(shí)萬古霉素的保留時(shí)間及峰形變化。結(jié)果表明，當(dāng)pH為3.2時(shí)，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間合適。因此流動(dòng)相中磷酸二氫鉀緩沖液的pH選擇為3.2。

醫(yī)學(xué)臨床上，血漿樣品的處理方面較為常用的有直接沉淀法和固相萃取法，這兩種方法在萬古霉素血漿樣品的處理中均有應(yīng)用[5][6]，本文采用直接沉淀法，以10%硫酸鋅作為沉淀劑，使用劑量少，且處理效果較好，處理后樣品對(duì)萬古霉素色譜峰無干擾。