楊欣欣，包永睿，王 帥，孟憲生* ，朱瑞卿，朱明香

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600;2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600;3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116600;4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 110001)

防己為防己科植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根，性味苦、寒，歸膀胱、肺經(jīng)［1］，為我國(guó)常用的中藥藥材，主產(chǎn)于浙江、廣東、廣西、安徽、福建等地，具有利水消腫、祛風(fēng)止痛的功效［2］。防己中的化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要有生物堿、雙黃酮類、揮發(fā)油、糖類等，現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明生物堿類成分為其主要藥效成分。防己生物堿類成分為多種異喹啉生物堿，其中含有量較高的有粉防己堿、防己諾林堿、輪環(huán)藤酚堿、二甲基粉防己堿以及小檗胺等，而粉防己堿和防己諾林堿更為其主要活性成分［3］，《中國(guó)藥典》2010年版也將上述兩種成分列為質(zhì)量控制的主要檢測(cè)對(duì)象。

隨著對(duì)防己化學(xué)成分研究的不斷深入，如何將有限的防己資源分離純化成更多、更純的有效成分具有廣泛的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。防己生物堿類成分的提取、純化工藝已受到越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外科研人員的關(guān)注，但目前關(guān)于防己生物堿類成分的提取、純化缺乏系統(tǒng)研究［4-9］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)防己中生物堿類成分提取和純化工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究，為防己藥材的合理利用及開(kāi)發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 LS6150型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) (TENGAO T＆D);Agilent 1100高效液相色譜儀 (二元泵，DAD檢測(cè)器)，ALC.1C.4電子天平 (SALTORIUS GROUP);HSS型電子恒溫水浴鍋 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);CP225D十萬(wàn)分之一分析天平 (德國(guó)Sartorius)。

1.2 藥品與試劑 防己藥材購(gòu)于大連市開(kāi)發(fā)區(qū)成大方圓藥店，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根;粉防己堿和防己諾林堿對(duì)照品 (供含量測(cè)定用，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)0793-200003、110711-200701);甲醇、冰醋酸 (色譜純，均購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心);乙腈 (色譜純，Mtedia公司)，水為去離子水;其它試劑均為分析純。

2 防己生物堿類成分提取工藝研究

2.1 色譜條件 Agilent-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水-冰醋酸 (40∶30∶30∶1)(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.41 g)［10-11］;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;柱溫25℃;體積流量1.0 mL/min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取粉防己堿和防己諾林堿對(duì)照品適量，加甲醇制成防己諾林堿、粉防己堿每1 mL含0.1370 mg、0.1001 mg的對(duì)照品溶液。

2.3 單因素水平考察 取防己藥材粉末5 g，精密稱定，分別選用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇溶液加熱回流提取，每次1 h，提取3次，濾過(guò)，合并濾液，3000 r/min離心15 min，將上清液濃縮至藥材質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的溶液，測(cè)定藥材中粉防己堿和防己諾林堿的量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溶劑提取結(jié)果

由表1結(jié)果可知，70%乙醇提取溶劑中粉防己堿、防己諾林堿的量均高于其他溶劑，故選用70%乙醇作為防己生物堿的最佳提取溶劑。

2.4 提取條件正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研和多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用L9(34)正交試驗(yàn)的方法確定考察因素為提取時(shí)間、溶媒量、提取次數(shù)，并選定3個(gè)水平，用以粉防己堿和防己諾林堿的量為主指標(biāo) (權(quán)重系數(shù)均為0.4)，干膏收率 (權(quán)重系數(shù)為0.2)為次指標(biāo)，即綜合指標(biāo)作為考察指標(biāo)，優(yōu)選防己生物堿的最佳提取條件，見(jiàn)表2。

表2 提取條件因素水平

2.5 出膏率試驗(yàn)和粉防己堿、防己諾林堿的測(cè)定 精密稱取防己藥材約5 g(過(guò)18目篩)，分別按上述因素水平表進(jìn)行提取，提取液3000 r/min離心15 min，上清液濃縮成含0.05 g/mL的溶液，用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。精密吸取上述溶液50 mL，水浴上蒸干 (置已恒重的蒸發(fā)皿中)，105℃干燥3 h，冷卻至室溫，迅速精密稱定所得干膏的質(zhì)量，計(jì)算出膏率。

用以藥材中粉防己堿和防己諾林堿的量為主指標(biāo) (權(quán)重系數(shù)均為0.4)，干膏收率 (權(quán)重系數(shù)為0.2)為次指標(biāo)，即綜合指標(biāo)作為考察指標(biāo)，優(yōu)選防己生物堿的最佳提取條件，其結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

以直觀及方差分析對(duì)防己生物堿類成分提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，各因素影響大小順序是B＞C＞A，各因素中均沒(méi)有顯著差異，因此確定防己生物堿類成分的最佳提取條件為A3B3C2，即8倍量70%乙醇回流提取3次，每次3 h。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明采用優(yōu)選的提取工藝條件 (A3B3C2)，粉防己堿、防己諾林堿的量以及出膏率均較高，且工藝穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 防己生物堿類成分純化工藝研究［12-15］

3.1 樹(shù)脂的預(yù)處理 選取不同極性的8種型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂一定量，用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇沖洗，洗至流出液與1∶2混合不產(chǎn)生混濁，再用蒸餾水洗，洗至無(wú)醇味，備用。

表5 最佳提取工藝驗(yàn)證

3.2 靜態(tài)吸附試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的HPD-400、HPD-450、 HPD-100、 D101、 AB-8、 NKA-9、 HPD-300、ADS-7樹(shù)脂各1 g，分別置100 mL錐形瓶中，精密加入最佳工藝樣品溶液 (0.4 g/mL)，室溫置水平搖床振搖 (90 r/min)24 h至充分吸附，濾過(guò)，測(cè)定濾液中粉防己堿、防己諾林堿的量，然后用90%乙醇對(duì)上述吸附飽和的樹(shù)脂進(jìn)行解吸 (操作條件同吸附)，測(cè)定解析液中粉防己堿、防己諾林堿的的量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同型號(hào)樹(shù)脂的靜態(tài)吸附量和解析率測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，各型號(hào)樹(shù)脂的吸附量、解吸率相差較大，綜合吸附和解吸兩方面的因素，AB-8型大孔樹(shù)脂的吸附量和解吸率均較高，最終確定AB-8樹(shù)脂為實(shí)驗(yàn)用防己生物堿類成分純化樹(shù)脂。

3.3 泄漏曲線考察 取0.2 g/mL的防己提取液緩緩?fù)ㄟ^(guò)已處理好的AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱 (樹(shù)脂柱床容積約為10 mL，1 BV=10 mL)，體積流量為2 BV/h，收集上樣流出液，每份10 mL，測(cè)定每份流出液中粉防己堿、防己諾林堿的量，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，流出藥液超過(guò)60 mL時(shí)，即6 BV時(shí)，流出液中粉防己堿、防己諾林堿的量顯著增大，說(shuō)明以粉防己堿、防己諾林堿為代表的生物堿類成分出現(xiàn)明顯泄漏，確定最大上樣量為樹(shù)脂柱體積的5倍，故確定即樹(shù)脂與上柱量之比為1 g/mL(藥材/濕樹(shù)脂)。

圖1 泄漏曲線考察

3.4 解析液考察 吸取防己最佳工藝樣品溶液(0.2 g/mL)，加入已處理好的AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱中，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，以5 BV水洗脫至無(wú)色后，再分別用水、10%、30%、50%、70%、90%乙醇各30 mL解析，體積流量2 BV/h，分別收集解析液，每份30 mL，測(cè)定不同質(zhì)量濃度解析液中粉防己堿、防己諾林堿的量，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，90%乙醇對(duì)粉防己堿、防己諾林堿的量的解析高于其他濃度的解析液，因此確定90%乙醇為最佳解析液。

3.5 解析液用量考察 吸取防己最佳工藝樣品溶液(0.2 g/mL)，加入已處理好的AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱中，用90%乙醇解析，體積流量2 BV/h，每份10 mL，收集解析液，測(cè)定粉防己堿、防己諾林堿的量，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，當(dāng)解析液達(dá)到8BV時(shí)，已基本將粉防己堿、防己諾林堿洗脫干凈，故確定解吸液用量為8 BV。

圖2 解析液的考察

圖3 解析液用量考察

3.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 取防己樣品液按上述方法選擇的工藝條件進(jìn)行吸附和洗脫，以粉防己堿、防己諾林堿的量計(jì)，總生物堿的純度可達(dá)50%。

4 結(jié)論與討論

4.1 防己生物堿類成分最佳提取工藝為8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次3 h;最佳純化工藝為選用AB-8型號(hào)樹(shù)脂，3倍柱體積水除雜，8倍量90%乙醇，藥材樹(shù)脂用量比1∶1(g/mL)，以粉防己堿、防己諾林堿量計(jì)，純化后純度約為50%。

4.2 實(shí)驗(yàn)中所用大孔吸附樹(shù)脂可以重復(fù)使用，成本低;大孔吸附樹(shù)脂操作簡(jiǎn)便，溶劑消耗也不大，避免了使用大量有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取的步驟，同時(shí)也減少了有機(jī)溶劑對(duì)人體的毒害。大孔吸附樹(shù)脂因其操作簡(jiǎn)單.快速、高效、低毒的良好性質(zhì)，使其在中草藥化學(xué)成分的提取分離研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛?，F(xiàn)在已有不同類型的大孔吸附樹(shù)脂，適用于分離不同性質(zhì)的化合物。

4.3 本實(shí)驗(yàn)以粉防己堿、防己諾林堿作為定量檢測(cè)指標(biāo)，優(yōu)選最佳純化工藝與與前期采用紫外分光光度法以總生物堿量作為定量檢測(cè)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該方法準(zhǔn)確可靠，可以作為防己生物堿類成分的檢測(cè)指標(biāo)。

4.4 本實(shí)驗(yàn)確定了中藥防己的最佳提取和純化工藝，方法操作簡(jiǎn)單，適合實(shí)際生產(chǎn)，為防己藥材的合理利用及開(kāi)發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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