潘 樂(lè)，李立青，徐 強(qiáng)

(黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山 245041)

水蜈蚣Kyllinga Brevifolia Rottb，又稱金鈕草、水金釵、散寒草，是莎草科水蜈蚣屬多年生草本植物。《民間常用草藥匯編》稱其能“散風(fēng)，除陳寒，止咳嗽”，中醫(yī)和臨床應(yīng)用研究表明其功能主治為疏風(fēng)、清熱、活血、解毒、發(fā)熱、百日咳、毒蛇咬傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和跌打損傷等［1-3］，這些功效與水蜈蚣的化學(xué)成分密切有關(guān)。目前，研究已發(fā)現(xiàn)水蜈蚣中存在著揮發(fā)油、黃酮類化合物、酚類化合物等化學(xué)成分［4-6］。多酚類化合物具備抗氧化、清除自由基、抗癌抗腫瘤、防治心腦血管疾病等特性，是一種重要的生物活性物質(zhì)［7］。但迄今為止，對(duì)水蜈蚣多酚提取的研究仍然較少，僅有賢景春等［6］采用正交設(shè)計(jì)對(duì)乙醇浸提水蜈蚣多酚進(jìn)行了研究。

由于超聲具有空化、粉碎、攪拌等特殊作用，因此超聲提取法與傳統(tǒng)的熱提取法和浸泡提取法相比較，具備提取時(shí)間短、操作便捷、產(chǎn)率高、無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于天然植物中多酚的提?。?-9］?？紤]到正交設(shè)計(jì)的局限性，本實(shí)驗(yàn)利用Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理［10-11］，采用效應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)超聲提取水蜈蚣多酚工藝進(jìn)行探索，優(yōu)化和確定了最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 水蜈蚣，購(gòu)于黃山市徽州醫(yī)藥有限責(zé)任公司，由黃山學(xué)院生命與環(huán)境學(xué)院汪立祥副教授鑒定，40℃下烘干12 h，粉碎后置于干燥器中保存;沒(méi)食子酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110831- 201004;三氯化鐵、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、鹽酸等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

電子分析天平 (梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司);循環(huán)水真空泵 (河南鞏義市英峪予華儀器廠);KQ-200VDB型超聲波清洗器 (昆山超聲儀器有限公司);UV-2200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (日本島津公司);JJ-2型小型組織粉碎機(jī) (萬(wàn)州江東機(jī)械廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取50 mg沒(méi)食子酸對(duì)照品，置于100 mL的棕色量瓶中，加水溶解并定容至100 mL，搖勻。精密量取10 mL置于100 mL棕色量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品，備用。

1.2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［12］分別精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL配置好的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，分別置于6個(gè)50 mL量瓶中，每個(gè)量瓶中依次加入0.100 mol/L三氯化鐵、0.008mol/L鐵氰化鉀和0.100 mol/L的鹽酸溶液各1.00 mL，以水定容至刻度，靜置15 min。以未加入沒(méi)食子酸對(duì)照品的樣品為試劑空白，在705 nm處測(cè)定吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品的提取 精密稱取1 g水蜈蚣樣品粉末，置于250 mL錐形瓶中。按一定的料液比 (1∶10～1∶35 g/mL)加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑 (30%～80%)，超聲提取一定時(shí)間 (15～40 min)，抽濾得濾液，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，用同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取劑定容至刻度。精密吸收10 mL，置于100 mL棕色量瓶中，加水定容，搖勻，即得樣品溶液。

1.2.4 多酚的測(cè)定 精密量取1 mL樣品溶液，按照“1.2.2”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法，測(cè)定其吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程得到樣品溶液中總多酚的濃度，計(jì)算水蜈蚣樣品中多酚提取率。

1.2.5 水蜈蚣多酚提取的單因素試驗(yàn) 分別以料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為變量，研究其對(duì)水蜈蚣多酚提取率的影響。

1.2.6 效應(yīng)面對(duì)提取工藝的優(yōu)化 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，采用效應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)水蜈蚣多酚工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“1.2.2”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=114.6x+0.0177，r2=0.9997，表明方程線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn) 單因素水平結(jié)果如圖1～3所示，由圖可知，超聲提取水蜈蚣多酚各單因素最佳提取條件為提取時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶25。

圖1 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平進(jìn)行效應(yīng)面分析。每因素設(shè)3水平，分別用代碼－1、0、1來(lái)表示。代碼值所代表的實(shí)際操作物理量，如表1。

表1 效應(yīng)面分析因素和水平

按表1的分析因素和水平，利用Design-Expert 8.0.3軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，得到實(shí)際結(jié)果如表2。

表2 效應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4 模型的建立及分析 利用Design-Expert 8.0.3軟件將表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行效應(yīng)面分析:以多酚提取率 (Y)為效應(yīng)值，分別對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù) (A)，料液比 (B)，提取時(shí)間(C)3個(gè)因素進(jìn)行多元回歸擬合，發(fā)現(xiàn)用二次階多項(xiàng)式回歸最優(yōu)，軟件得到的回歸方程如下:

二次多項(xiàng)式回歸方程:Y=5.76－0.00625A+0.26B+0.15C－0.18AB+0.11AC+0.053BC－0.36A2－0.17B2－0.30C2(r2=0.9142)

多元線性回歸方程:Y=5.37－0.00625A+0.26B+0.15C(r2=0.3504)

比較R2的大小，發(fā)現(xiàn)二次多項(xiàng)式回歸方程擬合明顯優(yōu)于多元線性擬合，刪除其中t檢驗(yàn)不顯著項(xiàng)，將二項(xiàng)式方程簡(jiǎn)化為:

Y=5.76+0.26B+0.15C－0.18AB+0.11AC－0.36A2－0.17B2－0.30C2(r2=0.9841)

對(duì)擬合方程進(jìn)行方差分析見(jiàn)表3。比較表3中各因素的P值可以看出乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)多酚提取率都有極顯著的影響;回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明影響提取的其他一些未知因素對(duì)試驗(yàn)干擾較小。因此，該方程較好地描述了總酚提取率隨各個(gè)因素的變化規(guī)律，具備較好的預(yù)測(cè)指導(dǎo)性。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2.5 提取工藝的優(yōu)化和預(yù)測(cè) 比較表3中AB、BC、AC這3組交互因素的P值，以AB的相互作用影響最大。利用Design-Expert 8.0.3軟件繪制多酚提取率 (Y)與相互作用最顯著的兩個(gè)自變量AB、BC、AC的三維效應(yīng)曲線面和等高線，如圖4～6所示。利用回歸模型，對(duì)模型方程求一階偏導(dǎo)可以得到模型的最佳提取條件為:料液比為11∶25.99，提取時(shí)間為 30.31min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為58.3772%，水蜈蚣多酚的理論提取率為5.81 mg/g。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取條件，考慮到實(shí)驗(yàn)的方便，將提取最佳條件修正為料液比為11∶26，提取時(shí)間為30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為58%，平行實(shí)驗(yàn)3次，多酚提取率分別為5.82、5.79、5.80 mg/g，平均值為5.80 mg/g，RSD為1.72%。表明所建立的數(shù)學(xué)模型具備精確的預(yù)測(cè)性，所選的工藝條件具有良好的重復(fù)性。

圖4 因素AB相互作用對(duì)提取率的三維效應(yīng)曲線面和二維等高線曲線圖

圖5 因素BC相互作用對(duì)提取率的三維效應(yīng)曲線面和二維等高線曲線圖

與文獻(xiàn)［6］中乙醇浸提法1.5 h的提取時(shí)間相比，超聲提取法僅需30 min，耗時(shí)明顯縮短，單位時(shí)間提取次數(shù)提高了2倍;同時(shí)超聲提取法5.80 mg/g的產(chǎn)率相比乙醇浸提法5.09 mg/g的產(chǎn)率，有13.95%的提高。綜合考慮單位時(shí)間提取次數(shù)和提取產(chǎn)率兩個(gè)因素，超聲提取工藝的提取效率明顯高于乙醇浸提工藝。

3 結(jié)論

圖6 因素AC相互作用對(duì)提取率的三維效應(yīng)曲線面和二維等高線曲線圖

天然植物中有效成分的提取工藝，較多的是采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，而利用Box-Behnken原理進(jìn)行方案設(shè)計(jì)，發(fā)揮計(jì)算機(jī)軟件Design-Expert功能強(qiáng)大的特性，可以得到更為精確的數(shù)學(xué)模型。本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響水蜈蚣多酚超聲提取的因素進(jìn)行了探討，確立水蜈蚣多酚的超聲提取工藝為:料液比為1∶26，提取時(shí)間為30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為58%，提取總多酚產(chǎn)率為5.80 mg/g。由于實(shí)驗(yàn)采用了Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)行擬合，充分考慮了各因素之間的相互作用，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)性，能更好地指導(dǎo)工藝。同時(shí)與乙醇浸提方法相比，超聲提取法在單位時(shí)間內(nèi)的提取次數(shù)和提取產(chǎn)率更高。本實(shí)驗(yàn)為傳統(tǒng)中草藥水蜈蚣的超聲提取工藝提供了準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，有助于水蜈蚣在現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。

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