張小俊，趙志鴻，張壯麗，王桂芳，陳慧平，鄒 敏

(1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450001;2.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室，河南鄭州 450052)

艾葉為菊科植物艾 Artemisia argyi Lévl.et Vant.的干燥葉，有溫經(jīng)止血、散寒止血之功效，在我國(guó)大部分地區(qū)都有分布［1］。揮發(fā)油是其主要有效成分群之一，有研究報(bào)道其對(duì)多種細(xì)菌、病毒、真菌有殺滅或抑制作用［2-3］。水蒸氣蒸餾法(Steam Distillation)是分析植物中揮發(fā)性成分的傳統(tǒng)提取技術(shù)［4-6］，但其所需樣品量大，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，提取效率低，易造成揮發(fā)性化合物的損失及化學(xué)變化。頂空萃取 (Headspace Extraction)是一種無溶劑、簡(jiǎn)單、快捷的提取植物中揮發(fā)性成分的新方法［7-8］。

本實(shí)驗(yàn)采用頂空萃取對(duì)樣品進(jìn)行處理，再用氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)11批不同產(chǎn)地艾葉中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，對(duì)其主要色譜峰進(jìn)行歸屬，建立指紋圖譜共有模式，并與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法建立的指紋圖譜進(jìn)行比較。同時(shí)運(yùn)用相似度計(jì)算軟件、聚類分析對(duì)其進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分類研究，為艾葉藥材中揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國(guó)Agilent公司);G1888頂空進(jìn)樣器 (美國(guó)Agilent公司);固相微萃取手柄及聚二甲基硅氧烷 (PDMS，100μm)萃取頭 (美國(guó) Supelco公司)，萃取頭在使用前按說明書上條件活化;AB135-S十萬分之一電子天平 (瑞士 METTLER TOLEDO公司);揮發(fā)油提取器;無水硫酸鈉 (分析純);正己烷 (色譜純);水為重蒸水。

1.2 樣品 艾葉分別購(gòu)自不同醫(yī)藥單位，由鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院劉晨江研究員鑒定，為Artemisia argyi Lévl.et Vant.的干燥葉，是 《中國(guó)藥典》收載的藥用品種。共11個(gè)樣品，產(chǎn)地詳見表1。

表1 樣品來源Tab.1 Samples from different sources

2 方法與結(jié)果

2.1 水蒸氣蒸餾法 取干燥的艾葉適量進(jìn)行粉碎，稱取100 g，精密稱定，加1 L水浸泡4 h，參照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XD［1］揮發(fā)油測(cè)定法 (甲法)提取。得到藍(lán)綠色油狀物，收油率為0.39%～0.61%。得到的揮發(fā)油用2 mL正己烷萃取，經(jīng)無水硫酸鈉干燥24 h后，取1 mL稀釋至10 mL，進(jìn)樣1 μL進(jìn)行測(cè)定。

2.2 頂空萃取法 取干燥的艾葉適量進(jìn)行粉碎，過40目篩，稱取1 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，用具有聚四氟乙烯墊的密封蓋密封，100 μmPDMS萃取頭80℃萃取40 min，之后在氣相色譜進(jìn)樣口250℃解吸附3 min，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。在萃取前，將萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口250℃活化10 min。萃取手柄深度規(guī)固定在#2。

2.3 GC-MS測(cè)定條件

2.3.1 色譜條件 DB-1毛細(xì)管柱(30 m×250 μm ×0.25 μm);載氣 He 氣 (99.999%)，柱流量1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度250℃;分流比20∶1;程序升溫，起始溫度50℃，維持5 min，以3℃/min升至200℃，再以20℃/min升至280℃，維持6 min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源 (EI);電子能量70 eV;離子源溫度230℃;接口溫度280℃;12～400 amu掃描;數(shù)據(jù)采集速率3.68次/s;水蒸氣蒸餾法溶劑延遲2.3 min。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 取1號(hào)藥材，分別按上述條件，同一樣品連續(xù)測(cè)定5次，考察色譜峰保留時(shí)間和峰面積的一致性。結(jié)果頂空萃取法各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.1%，相對(duì)峰面積的RSD＜0.3%;水蒸氣蒸餾法各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜0.03%。說明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性 取1號(hào)藥材，分別按上述條件，連續(xù)7 d進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果頂空萃取法各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.04%，相對(duì)峰面積的RSD＜0.4%;水蒸氣蒸餾法各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.03%，相對(duì)峰面積的RSD＜0.2%。說明一周內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性 取1號(hào)藥材，分別按上述條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果頂空萃取法各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.2%，相對(duì)峰面積的RSD＜4.1%;水蒸氣蒸餾法各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.03%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.2%。說明重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的分析與評(píng)價(jià)

2.5.1 特征共有峰的確定與歸屬 11批藥材，按“2.1”、“2.2”和“2.3”項(xiàng)條件提取和測(cè)定，得總離子流圖 (TIC)。圖1為1號(hào)藥材頂空萃取法總離子流圖，共檢出87個(gè)色譜峰。圖2為1號(hào)藥材水蒸氣蒸餾法總離子流圖，共檢出104個(gè)色譜峰。將GC-MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”中，設(shè)置兩點(diǎn)校正，得11批藥材總離子流色譜疊加圖，圖3和圖4分別為11批藥材頂空萃取法和水蒸氣蒸餾法總離子流色譜疊加圖。11批藥材頂空萃取法共有特征峰31個(gè)，水蒸氣蒸餾法共有特征峰37個(gè)，以1，8-桉葉油素作為參照峰(S)，分別計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并對(duì)共有峰用NIST05質(zhì)譜庫(kù)檢索進(jìn)行定性分析，匹配度90%以上作為準(zhǔn)確鑒定。結(jié)果見表2、表3。

圖1 1號(hào)藥材頂空萃取法總離子流圖Fig.1 TIC of sample 1 by headspace extraction

圖2 1號(hào)藥材水蒸氣蒸餾法總離子流圖Fig.2 TIC of sample 1 by steam distillation

圖3 11批藥材頂空萃取法總離子流色譜疊加圖Fig.3 TICs of 11 batches of samples by headspace extraction

圖4 11批藥材水蒸氣蒸餾法總離子流色譜疊加圖Fig.4 TICs of 11 batches of samples by steam distillation

表2 11批艾葉藥材頂空萃取法共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的比值Tab.2 Ratio of relative retention time(RTR)and relative peak area(RPA)of 11 batches of samples by headspace extraction

表3 11批艾葉藥材水蒸氣蒸餾法共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的比值Tab.3 Ratio of relative retention time(RTR)and relative peak area(RPA)of 11 batches of samples by steam distillation

續(xù)表3

2.5.2 指紋圖譜相似性分析 采用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，以軟件生成的對(duì)照?qǐng)D譜為對(duì)照模板，以?shī)A角余弦法進(jìn)行計(jì)算，得11批不同產(chǎn)地艾葉藥材中揮發(fā)性成分的相似性評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4，頂空萃取法與水蒸氣蒸餾法相似度計(jì)算結(jié)果基本一致，11批藥材的相似度都在0.9以上。

表4 11批艾葉藥材中揮發(fā)性成分的相似度Tab.4 Similarity of volatile components about 11 of batches of samples

2.5.3 系統(tǒng)聚類分析 聚類分析 (Cluster Analysis)是根據(jù)事物本身的特性研究個(gè)體分類的方法，可用于研究對(duì)象的分類與鑒定［9］。對(duì)頂空萃取法11批樣品中共有峰的相對(duì)峰面積用PASW Statistics軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用類間平均鏈鎖法 (Between-group Linkage)和歐氏平方距離(Squared Euclidean Distance)作為樣品測(cè)度，繪出樹狀圖，見圖5。

結(jié)果表明，11批樣品可以分為兩大類，樣品1、2、3、4、6、8、10，11聚為Ⅰ類，相似度都在0.96以上;樣品5、7、9聚為第Ⅱ類，相似度在0.96以下。樣品5、7、9中含龍腦、石竹烯及氧化石竹烯量較高。

3 討論

3.1 頂空萃取所得的31個(gè)共有特征峰中有21個(gè)峰與水蒸氣蒸餾所得的共有特征峰成分相同，雖然兩種方法所得共有特征峰及相對(duì)峰面積有差別，但兩種方法所得的相似性分析結(jié)果基本一致。與水蒸氣蒸餾相比，頂空萃取無溶劑、樣品用量少、快捷，適合大批量樣品處理。

圖5 11批艾葉藥材揮發(fā)性成分聚類分析圖Fig.5 Hierarchical cluster analysis figure of volatile components from 11 batches of samples

3.2 頂空萃取指紋圖譜中31個(gè)共有特征峰與水蒸氣蒸餾指紋圖譜中37個(gè)共有特征峰的特征成分在相對(duì)保留時(shí)間2.45以前比較相似，在此以后差別較大，可能是頂空萃取對(duì)高沸點(diǎn)物質(zhì)的選擇性較差。

3.3 在頂空萃取中相對(duì)含有量較高的成分有1，8-桉葉油素、α-蒎烯、1-甲基-4-(1-甲乙基)-苯、蒿酮、蒿醇、樟腦、龍腦、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、石竹烯、氧化石竹烯;在水蒸氣蒸餾中相對(duì)含有量較高的成分有1，8-桉葉油素、3，3，6-三甲基-1，4-庚二烯-6-醇、蒿酮、蒿醇、樟腦、龍腦、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、α-松油醇、順式-香芹醇、石竹烯、氧化石竹烯、表藍(lán)桉醇。在頂空萃取和水蒸氣蒸餾中相對(duì)含有量都較高的成分有1，8-桉葉油素、蒿酮、蒿醇、樟腦、龍腦、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、石竹烯、氧化石竹烯。

3.4 在對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度分析時(shí)，同文獻(xiàn)［6，10］遇到一樣的問題，儀器數(shù)據(jù)工作站導(dǎo)出的數(shù)據(jù)在用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版”與“中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”分析時(shí)格式不能兼容。后來發(fā)現(xiàn)可以用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”進(jìn)行處理。

3.5 本實(shí)驗(yàn)利用模式識(shí)別技術(shù)中的聚類分析對(duì)11批艾葉藥材中揮發(fā)性成分進(jìn)行研究。得到結(jié)果與通過相似度計(jì)算軟件計(jì)算結(jié)果一致，非常直觀，可與指紋圖譜相似度計(jì)算一起作為中藥質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)的科學(xué)依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:82，附錄63.

［2］梅全喜，高玉橋.艾葉化學(xué)及藥理研究進(jìn)展［J］.中成藥，2006，28(7):1030-1032.

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