萬(wàn) 峰，彭 成，曹小玉，熊 亮，魏曉露，周彥希

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611137;2.成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，四川成都 610036)

廣藿香為唇形科植物廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分，是我國(guó)著名南藥之一。廣藿香精油為廣藿香的主要藥用成分，有抗菌［1-2］、抗病毒［3］、驅(qū)蟲［4-5］、抗腫瘤［6］等藥理作用。此外，還可以作為化妝品、定香劑、殺蟲劑等日用品的生產(chǎn)配料［7］。自 1928年 Alexander Fleming偶然發(fā)現(xiàn)青霉素并應(yīng)用于臨床后，人類與感染性疾病的斗爭(zhēng)才有了階段性勝利。但濫用抗生素致使耐藥菌急劇增加的現(xiàn)象，無(wú)可避免的讓我們聯(lián)想到，“無(wú)藥可救”的后抗生素時(shí)代。有潛力出現(xiàn)新型抗菌藥物的中藥，以其毒副作用小而備受關(guān)注，且中藥不易使細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性［8］。

綜合文獻(xiàn)以及本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)廣藿香精油在體外具有很強(qiáng)抑菌活性，但尚未見(jiàn)和其相關(guān)的抑菌機(jī)理報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為供試菌，通過(guò)研究廣藿香精油對(duì)甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌 (MSSA)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)的體外抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌曲線、超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁透性和肽聚糖的量、膜蛋白構(gòu)象和離子滲漏的影響等方面，來(lái)闡述廣藿香精油的抑菌活性及作用機(jī)制，旨在為開(kāi)發(fā)高效低毒的純天然抗菌藥物提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試藥物 廣藿香，購(gòu)自廣東省湛江雷州市，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室李敏老師鑒定為唇形科植物廣藿香 Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分。粉碎后用水蒸氣蒸餾法［9］提取廣藿香精油，經(jīng)GC-MS［10］測(cè)得其中含廣藿香醇量為42.1%。臨用時(shí)用0.5%的吐溫-80配置為供試藥物。

1.2 菌株 質(zhì)控菌種金黃色葡萄球菌ATCC 25923和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC 43300，臨床分離到4株對(duì)甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)和1株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)，現(xiàn)均保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室。實(shí)驗(yàn)前將菌種保存液復(fù)活接種于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單菌落接種于5～10 mL的LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)3 h。取100 μL菌液均勻涂布于LB固體平板，倒置培養(yǎng)16～18 h后收集活菌作實(shí)驗(yàn)用。

1.3 主要試劑與儀器 Mueller-Hinton agar(OXOID);SLP-HS Single Reagent Set(和光純藥工業(yè)株式會(huì)所);碘化鉀 (KI)(成都市科龍化工試劑廠);堿性磷酸酶 (AKP)試劑盒、Mg試劑盒及K試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。

7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀 (Agilent)，VARIOSKAN Flash(Thermo scientific)，Tecnai G2 F20(FEI)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 體外抑菌活性的測(cè)定 采用瓊脂平板二倍稀釋法測(cè)定廣藿香精油對(duì)受試菌的最低抑菌濃度(MICs)，將過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌稀釋成1.5×106CFU/mL，使用多點(diǎn)接種儀接種于含藥MH瓊脂平板，將平板培養(yǎng)18～24 h后測(cè)定廣藿香精油對(duì)細(xì)菌的 MICs［12］。

2.2 抑菌曲線的測(cè)定 采用生長(zhǎng)曲線法［13］測(cè)定廣藿香精油對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，將不同質(zhì)量濃度的藥物組、對(duì)照組振蕩培養(yǎng)后，使用酶標(biāo)儀每隔2 h測(cè)定其在600 nm的OD值。平行測(cè)定3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

2.3 對(duì)超微結(jié)構(gòu)的影響 使用透射電鏡觀察廣藿香精油對(duì)細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的影響［14］。在含有供試細(xì)菌1.5×106CFU/mL的LB液體培養(yǎng)基中，加入廣藿香精油使其在菌液中的濃度為1/2 MIC，振蕩培養(yǎng)18 h后，收集菌液后按透射電鏡樣品制備法［15］制樣，在電鏡下觀察菌體外觀形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。

2.4 對(duì)細(xì)胞壁透性的影響 在菌液中加入不同質(zhì)量濃度的廣藿香精油，充分混勻后于37℃震蕩培養(yǎng)5 min，同時(shí)設(shè)定藥物自身對(duì)照組，用酶標(biāo)儀按堿性磷酸酶試劑盒使用方法于520 nm測(cè)定菌液中的堿性磷酸酶活性。同時(shí)平行測(cè)定3次。

2.5 對(duì)細(xì)胞壁肽聚糖量的影響 按照肽聚糖檢測(cè)試劑盒使用方法配制試劑并加入菌液，混勻后于30℃水浴10 min，然后加入不同質(zhì)量濃度的廣藿香精油，混勻后使用酶標(biāo)儀于650 nm(檢測(cè)溫度30℃，30 s自動(dòng)檢測(cè)1次)，連續(xù)檢測(cè)2 min，同時(shí)設(shè)定藥物自身對(duì)照組，測(cè)定肽聚糖的量，以光密度 (optical density，OD)值表示。同時(shí)平行測(cè)定3次。

2.6 對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)鉀、鎂離子滲漏的測(cè)定 在菌液中加入不同質(zhì)量濃度的廣藿香精油，在37℃水浴2 min，按照離子測(cè)試試劑盒的使用說(shuō)明，同時(shí)設(shè)定藥物自身對(duì)照組，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)菌液中含鉀、鎂離子的量。平行測(cè)定3次。

2.7 對(duì)膜蛋白構(gòu)象的影響 固定苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸 (Tyr)、色氨酸 (Trp)3種氨基酸殘基在細(xì)菌膜蛋白中的發(fā)射波長(zhǎng)，在200 nm到400 nm范圍內(nèi)掃描它們各自的激發(fā)波長(zhǎng)。根據(jù)Phe、Tyr、Trp 3種氨基酸殘基的激發(fā)波長(zhǎng)Ex，固定Ex，在200 nm到800 nm范圍內(nèi)掃描它們?cè)诩?xì)菌膜蛋白中的發(fā)射波長(zhǎng)Em［16］。加入不同濃度的熒光淬滅劑碘化鉀，檢測(cè)碘化鉀對(duì)3種氨基酸殘基發(fā)射波長(zhǎng)Em的峰位和峰高的影響，確定氨基酸殘基位于膜內(nèi)還是膜外。最后在一定濃度的菌液中加入不同質(zhì)量濃度的廣藿香精油，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)藥物對(duì)選定氨基酸殘基發(fā)射波長(zhǎng)Em峰位和峰高的影響。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外抑菌活性 由表1可知，廣藿香精油對(duì)7株受試細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌臨床分離病原菌的敏感菌MSSA及耐藥菌MRSA的MICs均為0.51 mg/mL。

3.2 對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響 由圖1可知，不加入廣藿香精油，空白組金黃色葡萄球菌2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h進(jìn)入穩(wěn)定期;加入0.26 mg/mL的廣藿香精油，細(xì)菌8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，并很快進(jìn)入衰亡期，細(xì)菌量較空白組明顯減少;加入0.13 mg/mL的廣藿香精油，細(xì)菌6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌量較空白組減少;加入0.06 mg/mL的廣藿香精油，細(xì)菌4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h進(jìn)入穩(wěn)定期。結(jié)果表明0.26、0.13 mg/mL的廣藿香精油均能明顯延長(zhǎng)金黃色葡萄球菌的延遲期，明顯抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

表1 廣藿香精油的體外抑菌活性Tab.1 In vitro antibacterial activity of the essential oil from Pogostemon cablin

圖1 廣藿香精油對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Impact of essential oil from Pogostemon cablin on the growth curve of Staphylococcus aureus

3.3 對(duì)超微結(jié)構(gòu)的影響 由圖2可知，正常金黃色葡萄球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞膜、胞壁、胞質(zhì)及其內(nèi)含物和核質(zhì)體結(jié)構(gòu)清晰，位于細(xì)胞的中央。在0.26 mg/mL的廣藿香精油作用下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，胞膜損傷，胞質(zhì)內(nèi)含物及其核質(zhì)體被溶解，溶解物滲漏出胞外，后期細(xì)胞空化死亡。

3.4 對(duì)細(xì)胞壁透性的影響 由圖3可知，廣藿香精油作用于金黃色葡萄球菌后，細(xì)菌胞外可檢測(cè)到的堿性磷酸酶活性明顯增加，且與劑量成正相關(guān)，表明廣藿香精油可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁透性的變化。

3.5 對(duì)細(xì)胞壁肽聚糖量 (以對(duì)應(yīng)OD值表示)的影響 由圖4可知，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的重要組成成分肽聚糖對(duì)應(yīng)OD值在不同質(zhì)量濃度的廣藿香精油作用下，在檢測(cè)時(shí)間2 min以內(nèi)，無(wú)明顯變化，說(shuō)明細(xì)胞壁肽聚糖的量變化不大。

圖2 廣藿香精油對(duì)金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Impact of essential oil from Pogostemon cablin on the ultrastructure of Staphylococcus aureus

圖3 廣藿香精油對(duì)金黃色葡萄球菌堿性磷酸酶活性的影響Fig.3 Impact of essential oil from Pogostemon cablin on the activity of Staphylococcus aureus extracellular alkaline phosphatase

3.6 對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)鉀、鎂離子滲漏的測(cè)定 由圖5可知，廣藿香精油可使金黃色葡萄球菌菌液中的K+、Mg2+可檢出量明顯增加，且呈明顯的量效關(guān)系;表明廣藿香精油可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌胞內(nèi)的K+、Mg2+出現(xiàn)滲漏。

圖4 廣藿香精油對(duì)細(xì)胞壁肽聚糖量的影響Fig.4 Impact of drugs on the content of peptidoglycan

3.7 對(duì)膜蛋白構(gòu)象的影響 將金黃色葡萄球菌膜蛋白上 Phe，Tyr和 Trp的發(fā)射波長(zhǎng)分別固定在282 nm、303 nm和348 nm，使用酶標(biāo)儀掃描，得知Phe的激發(fā)波長(zhǎng)是286 nm，Tyr的激發(fā)波長(zhǎng)是297 nm，Trp的激發(fā)波長(zhǎng)是342 nm。

圖5 廣藿香精油對(duì)金黃色葡萄球菌K+、Mg2+滲漏的影響Fig.5 Determination of essential oil from Pogostemon cablin on Staphylococcus aureus intracellular potassium ion and magnesium ion leakage

通過(guò)在菌液中添加碘化鉀溶液發(fā)現(xiàn)，低濃度的碘化鉀就能使金黃色葡萄球菌的Trp和Tyr殘基的熒光強(qiáng)度受到淬滅的影響，可以推斷出Trp和Tyr殘基位于細(xì)胞膜外;而高濃度的碘化鉀才可使金黃色葡萄球菌Phe殘基的熒光強(qiáng)度受到影響，同時(shí)熒光強(qiáng)度是逐漸降低的，可以推斷出Phe殘基位于細(xì)胞膜內(nèi)，當(dāng)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，位于膜內(nèi)部的Phe殘基暴露出來(lái)并與碘化鉀結(jié)合。因此，選擇Phe殘基來(lái)研究廣藿香精油與金黃色葡萄球菌膜蛋白的相互作用。

從圖6可知，廣藿香精油可淬滅金黃色葡萄球菌Phe殘基的熒光強(qiáng)度，且隨著廣藿香精油濃度的增加，Phe殘基的熒光強(qiáng)度相應(yīng)的下降。由此表明廣藿香精油可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌膜蛋白構(gòu)象改變。

4 討論

圖6 廣藿香精油對(duì)金黃色葡萄球菌Phe殘基的影響Fig.6 Impact of essential oil from Pogostemon cablin on Staphylococcus aureus Phe

近年來(lái)植物精油的抑菌活性屢見(jiàn)報(bào)道，如馬纓丹精油對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯菌的 MICs為350 ～400 mg/mL［17］，Seseli rigidum 精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、糞腸球菌等常見(jiàn)病原菌 MICs為6.25～25 mg/mL［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣藿香精油在體外有很強(qiáng)抑菌活性，不僅對(duì)金黃色葡萄球菌敏感菌有很強(qiáng)的抑菌效力，而且對(duì)金黃色葡萄球菌的耐藥菌MRSA亦有很強(qiáng)的抑菌活性，且MICs均為0.51 mg/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道一致［19-20］。生長(zhǎng)曲線法不僅可以揭示藥物的抑菌效力，且可通過(guò)微生物的生長(zhǎng)曲線反映群體的生長(zhǎng)規(guī)律，并從中知曉藥物對(duì)微生物產(chǎn)生的效果以及時(shí)間藥效的變化情況等多種的信息［21］。本研究采用該法發(fā)現(xiàn)，廣藿香精油可抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，與體外試驗(yàn)結(jié)果一致，并可延長(zhǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)延遲期。

細(xì)菌主要由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、核質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)等構(gòu)成。細(xì)胞膜是由蛋白質(zhì)、脂類等組成的超分子體系，與細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)送、信息識(shí)別與傳遞等生命活動(dòng)均密切相關(guān)。細(xì)菌的細(xì)胞壁有協(xié)助細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)、提高機(jī)械強(qiáng)度、保持細(xì)胞外形、抑制機(jī)械損傷、介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用、防止大分子入侵等生理功能。精油的抑菌靶點(diǎn)有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等［22-24］。通過(guò)廣藿香精油對(duì)金黃色葡萄球菌的超微結(jié)構(gòu)的研究表明廣藿香精油可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的結(jié)構(gòu)完整性和胞膜受損，細(xì)菌的胞漿內(nèi)容物滲漏。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組成成分之一;堿性磷酸酶是存在于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁、膜之間的一種酶，正常情況下，在胞外不能檢測(cè)到其活性。但當(dāng)細(xì)胞壁受到破壞而導(dǎo)致透性增加，則其將泄漏到胞外［25］。通過(guò)研究廣藿香精油對(duì)細(xì)胞壁透性和肽聚糖量的影響，結(jié)果表明廣藿香精油可明顯增加金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁透性，但在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)對(duì)受試細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖的量無(wú)明顯影響。

膜蛋白是鑲嵌于膜脂的一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的蛋白質(zhì)，可介導(dǎo)細(xì)胞和外界之間信號(hào)的傳導(dǎo)，并執(zhí)行許多基本以及重要的細(xì)胞生物學(xué)功能，如構(gòu)成了離子跨膜的通道［26］，構(gòu)成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［27］等。Mg2+、K+維持是細(xì)菌正常生命活動(dòng)不可或缺的金屬離子［28］，同時(shí)也是維持細(xì)胞滲透壓平衡的重要鹽類物質(zhì)。細(xì)菌胞內(nèi)的K+、Mg2+一般是不會(huì)同時(shí)大量的滲出胞膜的，若Mg2+、K+大量泄漏到細(xì)胞外，表明細(xì)胞膜受到了損傷［29］。通過(guò)研究廣藿香精油對(duì)金黃色葡萄球菌膜蛋白構(gòu)象和離子滲漏的影響，結(jié)果表明廣藿香精油可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌膜蛋白構(gòu)象的變化，胞內(nèi)的K+、Mg2+大量滲出，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與電鏡結(jié)果相一致。綜上所述，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證了廣藿香精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制與影響細(xì)胞膜有關(guān)。

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