陳 萌，談立偉，許 娜，馮大千，劉國良，王 偉

(1.南京工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江蘇南京 211800;2.鹽城工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

納米生物技術(shù)是整合了納米技術(shù)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)等的交叉學(xué)科，在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用和明確的產(chǎn)業(yè)化前景。在過去的幾十年，納米材料在生命科學(xué)領(lǐng)域中有諸多應(yīng)用，特別是利用熒光納米材料作為熒光標(biāo)記物在生物學(xué)中的應(yīng)用發(fā)展是一個特別有吸引力的研究領(lǐng)域［1］。目前為止，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種不同類型的熒光納米材料，包括半導(dǎo)體量子點［2］、染料摻雜納米粒子［3］、碳納米點［4］等。然而相比于這些小分子熒光染料，熒光金屬納米團(tuán)簇，特別是熒光金納米團(tuán)簇(gold nanocluster，Au NCs)，具有低毒性、表面易于修飾、熒光穩(wěn)定性強(qiáng)且可調(diào)等優(yōu)點。Au NCs是由幾個至幾十個金原子組成的具熒光、水溶性的穩(wěn)定的聚集體，是一種新型的熒光納米材料［5］。納米團(tuán)簇的直徑通常小于2 nm，介于單原子和納米粒子或大體積的金屬之間，由于特有的尺寸致其在可見區(qū)到近紅外區(qū)范圍內(nèi)顯示出尺寸依賴的熒光性能。Au NCs的特點大大改善了熒光探針的生物檢測應(yīng)用的性能，提升了現(xiàn)有分析方法的特異性和靈敏度。在分析檢測、生物探針、細(xì)胞標(biāo)記及熒光成像等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［6-8］。

本文概述了金屬納米團(tuán)簇，主要是具有熒光性質(zhì)的金納米團(tuán)簇的制備方法，并結(jié)合目前金納米團(tuán)簇應(yīng)用的最新進(jìn)展介紹了其在生物傳感檢測，包括金屬離子、陰離子、有機(jī)小分子、蛋白質(zhì)和核酸等各種分析物檢測中的應(yīng)用。同時，簡要評述和展望了熒光金納米團(tuán)簇研究所面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展方向。

1 熒光金屬納米團(tuán)簇的制備

金納米團(tuán)簇特殊的尺寸和光電性質(zhì)使得其在生物標(biāo)記以及藥物分析等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。目前熒光金納米團(tuán)簇的合成方法有多種分類［6，9］，按照保護(hù)基團(tuán)的不同可分為模板法和單分子層保護(hù)法兩類。具體的保護(hù)劑或模板劑可分為硫醇、樹枝狀聚合物、蛋白質(zhì)等［10-12］。選擇合適的保護(hù)劑和模板對提高金簇的熒光等性能有著關(guān)鍵的作用。因此，我們將基于不同類型的保護(hù)劑或模板對熒光金納米團(tuán)簇的合成做出介紹。

1.1 硫醇類化合物

硫醇類化合物是最常見的金屬納米團(tuán)簇合成中的保護(hù)劑分子。通過在金簇表面修飾或組裝一層分子而形成的具有特定功能的納米團(tuán)簇。Brust等［13］首次以氯金酸根離子為前體，利用兩相法在十二烷基硫醇(DDT)存在的情況下，合成了1～3 nm的金納米團(tuán)簇。之后更多硫醇類化合物用作金納米團(tuán)簇的合成被報道，如二氫硫辛酸(DHLA)［14，15］、谷胱甘肽(glutathione，GSH)［16］、半胱氨酸(cysteine)［17］、十二烷基硫醇(dodecanethiol，DDT)［18］、D-3- 巰基纈氨酸(DPA)等(圖 1)［19］。Tsukuda研究小組成功制備并分離了谷胱甘肽保護(hù)的金簇。該小組進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Au25(SG)18能夠防止核心蝕刻，且穩(wěn)定性最好［20］。隨后，該實驗組采用Au11(PPh3)8Cl3為前體，利用Hutchison等［21］建立的配體交換反應(yīng)，GSH為交換配體優(yōu)先得到Au25(SG)18，其產(chǎn)量提高了100多倍，進(jìn)而證明了Au25(SG)18的高穩(wěn)定性。

1.2 樹狀大分子和聚合物

聚合物及樹狀大分子由于含有豐富的羧酸基團(tuán)，并可控制金原子和溶液之間的結(jié)合能力，被認(rèn)為是一種很有前景的合成尺寸較小、熒光度高、水溶性的金納米團(tuán)簇模板。聚合物是最早用來合成金屬納米團(tuán)簇的模板，金屬團(tuán)簇的粒徑也能很好地控制，聚合物作為衣殼還能防止外界物質(zhì)對金納米團(tuán)簇?zé)晒獾拟缱饔谩＞哿姿猁}(polyphosphate)首次被報道用作保護(hù)基團(tuán)以防止Ag NCs聚合［22］。此后，聚苯胺(polyaniline，PANI)［23］、聚酰胺氨型樹狀大分子(poly(amidoamine)，PAMAM)［24］、聚乙醇胺(polyethylenimine，PEI)［25］等更多合成金簇的聚合物被陸續(xù)報道。然而這些聚合物模板由于存在制備方法復(fù)雜、耗時長等缺點，給金屬納米團(tuán)簇的合成過程加大了難度。

1.3 蛋白質(zhì)或多肽等生物大分子

近年來研究人員發(fā)現(xiàn)生物大分子諸如蛋白質(zhì)和核酸等也可以作為合成金納米團(tuán)簇的模板。蛋白質(zhì)或多肽作為模板合成的金屬團(tuán)簇具有廣闊的應(yīng)用空間和良好的發(fā)展前景，它們在合成和穩(wěn)定金納米團(tuán)簇的過程中起著重要的作用，使得其在后期的生物標(biāo)記和醫(yī)學(xué)診斷方面有著更為突出的優(yōu)勢。2009年Xie等［12］報道了一種環(huán)保無毒的合成金納米團(tuán)簇的方法，他們利用牛血清蛋白(BSA)作為模板在37℃下合成了最大發(fā)射波長在630 nm處的 BSA-Au NCs，其粒徑約為0.8 nm，且具有非常高的穩(wěn)定性。最近，Wei等［26］采用溶菌酶(lysozyme)作為殼層分子合成了粒徑約為1 nm，最大發(fā)射波長在657 nm處的金納米團(tuán)簇，具有較好的穩(wěn)定性。Zhou等［27］發(fā)現(xiàn)組氨酸、GSH和DNA等生物分子在超聲波的輔助下蝕刻金納米顆粒形成粒徑小的金簇，在365 nm的激發(fā)波長處其在430～450 nm處出現(xiàn)強(qiáng)熒光。

2 金納米團(tuán)簇的熒光分析方法與生物檢測應(yīng)用

熒光金納米團(tuán)簇所展現(xiàn)出的尺寸小、水溶性好、低毒性、表面易于修飾、熒光穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點，使其為生物分析及醫(yī)學(xué)診斷研究提供了新的標(biāo)記手段，開辟了新的應(yīng)用領(lǐng)域。利用金納米團(tuán)簇的熒光猝滅原理設(shè)計的熒光探針能特異性地檢測環(huán)境中的化學(xué)和生物制劑等。在這一節(jié)中我們簡單介紹利用熒光探針進(jìn)行熒光分析檢測的方法，并就熒光金納米團(tuán)簇作為熒光探針實現(xiàn)對各種重要分析物檢測的研究進(jìn)展作了總結(jié)。

2.1 熒光和共振光散射分析方法

金納米材料的熒光和共振光散射特性得到較多的關(guān)注［28］。金納米團(tuán)簇常被作為最重要的熒光和共振光散射指示器用于包括免疫分析、DNA測定等一些特殊分析檢測。在進(jìn)行熒光分析時一般采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法，即取各種已知量的熒光物質(zhì)，配成一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定出這些標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，然后給出熒光強(qiáng)度對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的工作曲線。在同樣的儀器條件下，測定未知樣品的熒光強(qiáng)度，然后從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出未知樣品的濃度(即含量)。

2.2 熒光金納米團(tuán)簇在生物檢測中的應(yīng)用

2.2.1 檢測金屬離子

Hg2+、Cu2+、Pb2+等是自然界中常見的重金屬離子污染物，對人類的健康產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的危害。Cu元素缺乏能引發(fā)各種疾病，但是高濃度的銅也會對生物體造成危害;微量的Hg2+會對大腦、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟造成極大地傷害。Huang等［10］發(fā)現(xiàn)在 Hg2+的參與下硫醇 -巰十一烷酸(11-MUA)保護(hù)的金納米團(tuán)簇(11-MUA-Au NCs)的熒光會發(fā)生強(qiáng)烈猝滅。由此可對Hg2+實現(xiàn)高靈敏度的檢測，最低檢測限為5 nM。金納米團(tuán)簇上包覆的羧酸根與重金屬離子配位形成團(tuán)聚，導(dǎo)致熒光的猝滅。2009年，Xie等［29］利用牛血清蛋白BSA作為模板合成了具有紅色熒光的BSA-Au NCs，發(fā)現(xiàn)其可以對Hg2+實現(xiàn)高靈敏度的檢測，檢測低至 0.5 nM。Chai等［30］通過檢測湖水中的Hg2+，提出由于BSA表面上的氨基和羧基與Hg2+結(jié)合而導(dǎo)致熒光猝滅的機(jī)理。

與此類似的是，Durgadas等［31］發(fā)現(xiàn) Cu2+會與包覆在Au NCs表面的BSA結(jié)合使其熒光猝滅。他們利用此原理設(shè)計了熒光檢測Cu2+濃度的傳感器，檢測限為50 μM，并且可以通過進(jìn)一步優(yōu)化條件使檢測更加靈敏。當(dāng)加入Cu2+的螯合劑甘氨酸后熒光又得以恢復(fù)。Chen等［32］利用谷胱甘肽與金納米團(tuán)簇表面發(fā)生配位合成的GSH-Au NCs檢測水中的Cu2+，檢測限低至3.6 nM。值得注意的是加入金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)后，被猝滅的熒光也可得到恢復(fù)。隨后該小組又報道了一種熒光金納米團(tuán)簇探針實現(xiàn)了對 Cu2+的靈敏性檢測［33］。He 等［34］運用了微波加熱的方法，用7 min合成了高量子產(chǎn)率的GSH-Au NCs。該材料對Cu2+有很好靈敏性檢測，檢測限低至0.3 nM。其機(jī)理是由于GSH-Au NCs表面大量存在的GSH與Cu2+以2∶1的方式配位結(jié)合，導(dǎo)致金納米團(tuán)簇的聚集，產(chǎn)生明顯的熒光猝滅作用。

金納米團(tuán)簇不僅可以用來檢測Hg2+、Cu2+等重金屬離子，還被用來檢測其他金屬離子，如Ni2+、Pb2+、Fe2+、季銨陽離子等。Kawasaki等［35］首次報道了Pb2+能使金納米團(tuán)簇?zé)晒庠鰪?qiáng)，熒光強(qiáng)度會隨著Pb2+濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)在合成的金納米團(tuán)簇(Pep-Au NCs)加入50 μM的Pb2+后，熒光強(qiáng)度增加至原來的8倍?；谂潴w交換的方法，Yuan等［36］合成Pb2+可以使GSH和11-MUA共同保護(hù)的熒光金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)生強(qiáng)烈猝滅，從而可以起到對Pb2+的靈敏性檢測，該方法檢測限低至5 nM。

2.2.2 檢測陰離子

碘元素是人體的微量元素，對人體的生長發(fā)育起著很重要的作用。研究表明，碘缺乏可以引起很多疾病，但是，碘濃度高對生物機(jī)體組織也具有毒副作用，因此，建立準(zhǔn)確靈敏的I-檢測方法具有非常重要的意義。Wang等［37］使用GSH為模板合成的金納米團(tuán)簇(Au25(SG)18)作為熒光檢測I-濃度的傳感器，檢測限達(dá)到400 nM，并且可以通過進(jìn)一步優(yōu)化條件使檢測更加靈敏。

氰化物是一種廣泛存在于自然界，尤其是生物界的劇毒物質(zhì)，它們可由某些細(xì)菌，真菌或藻類制造，存在于相當(dāng)多的食物與植物中，其毒性跟CN-對重金屬離子的超強(qiáng)絡(luò)合能力有關(guān)，因此實現(xiàn)對CN-的靈敏檢測刻不容緩。Liu等［38］發(fā)現(xiàn)CN-可以使BSA為模板合成的BSA-Au NCs中的Au氧化從而破壞金納米團(tuán)簇的機(jī)構(gòu)，其反應(yīng)機(jī)理如反應(yīng)式(4)所示。該過程會導(dǎo)致熒光猝滅，達(dá)到檢測CN-濃度的目的。相比其他CN-的光學(xué)檢測方法，利用金納米團(tuán)簇實現(xiàn)對CN-的檢測更具有抗干擾性。

Yan等［39］發(fā)現(xiàn)在酸性條件下NO-2可以使人血清蛋白保護(hù)的金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)生強(qiáng)烈猝滅，從而起到對NO-2的檢測作用。該檢測方法在2.0×10-8M 至5.0×10-5M 時成線性良好，最低檢測限達(dá)到2.2 μM。該小組提出由于酸性環(huán)境下NO2-產(chǎn)生了氮氧化合物，這些氮氧化合物才是該金納米團(tuán)簇?zé)晒忖绲奈镔|(zhì)。

2.2.3 檢測雙氧水

雙氧水(hydrogen peroxide，H2O2)是許多化工、醫(yī)藥和環(huán)境變化過程中都涉及到的分析物，幾乎是所有氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物，為人類在許多疾病的早期診斷階段對體液的分析起著重要的作用。近期，Jin等［40］利用合成的具有紅色熒光的BSA-Au NCs，通過實驗發(fā)現(xiàn)在H2O2的參與下金納米團(tuán)簇?zé)晒忖缑黠@，檢測限為3 μM。他們將熒光猝滅歸因于金簇在H2O2的參與下發(fā)生如反應(yīng)式5、式6的變化。

葡萄糖是生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，葡萄糖的定量測定在臨床化學(xué)、生物化學(xué)和食品分析中都占有很重要的地位。此外，血糖水平也是人類健康狀況的一個指標(biāo)，血糖的異樣為人類的疾病，如糖尿病或低血糖提供了產(chǎn)生信號。葡萄糖和人體許多疾病相關(guān)，如葡萄糖代謝紊亂、胰島細(xì)胞癌等，因此能夠快速準(zhǔn)確檢測人體血糖濃度是診斷這些疾病的一個重要因素。到目前為止，Shiang 等［41］和 Jin 等［40］將葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖作用產(chǎn)生過氧化氫，再分別利用過氧化氫使辣根過氧化酶(HRP)和牛血清蛋白保護(hù)的金納米團(tuán)簇的熒光猝滅(圖3)。基于這一現(xiàn)象間接檢測葡萄糖，實現(xiàn)對血樣中葡萄糖的靈敏檢測，檢測限(LOD)分別達(dá)到了1 μM和5 μM。

圖3 HRP-Au NCs的合成和H2O2誘導(dǎo)熒光淬火示意圖Fig.3 Schematic representation of the formation of HRP-Au NCs and the H2O2-induced quenching

2.2.4 檢測其他有機(jī)小分子化合物

維他命B12、鹽酸柔紅霉素、環(huán)丙沙星、槲皮素、多巴胺等有機(jī)小分子化合物也可以對金納米團(tuán)簇的熒光產(chǎn)生不同程度的響應(yīng)。這些物質(zhì)或是存在于人體或是存在于各種藥物之中，通過熒光金納米團(tuán)簇實現(xiàn)其靈敏檢測在醫(yī)學(xué)診斷、生物制藥等方面意義重大。Chen等［42］用環(huán)丙沙星恢復(fù)Au NCs被Cu2+抑制的熒光，實現(xiàn)對環(huán)丙沙星的靈敏檢測，檢測限為0.3 ng/mL。該檢測穩(wěn)定，可重復(fù)性高。

Samari等［43］報道了一種金納米團(tuán)簇傳感器，可以運用于醫(yī)藥制劑中維他命B12的分析。其利用牛血清蛋白為模板合成的Au NCs為能量給體，維他命B12為能量受體，兩者發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，建立了一種靈敏檢測維生素B12的方法。

2.2.5 檢測氨基酸和蛋白質(zhì)

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，它與生物的生命活動有著密切的關(guān)系，是生物體內(nèi)不可或缺的營養(yǎng)成分之一，其中半胱氨酸在機(jī)體代謝中扮演著關(guān)鍵的角色，它能與有毒的芳香族化合物縮合成硫醚氨酸而起解毒作用。半胱氨酸的缺乏能引起很多組織、器官的病變，如肝損傷、皮膚疾病以及免疫系統(tǒng)損傷等，因此對于半胱氨酸的靈敏檢測顯得尤為重要［44］。Cui等［45］發(fā)現(xiàn)半胱氨酸可以使BSA-Au NCs的表面缺陷降低從而使其熒光性增強(qiáng)，該小組設(shè)計的半胱氨酸的檢測方法，最低檢測限達(dá)到1.2 μM。

選擇性受體分子(如抗體和核酸適配體)和金納米團(tuán)簇表面的結(jié)合已經(jīng)被應(yīng)用于金納米團(tuán)簇?zé)晒獾牡鞍踪|(zhì)檢測。2006年Triulzi等［46］首先報道了將金納米團(tuán)簇運用到蛋白質(zhì)的檢測中來。Huang等［47］提出了一種分析和檢測蛋白質(zhì)的方法，他們運用競爭性同源熒光猝滅法，選擇一段能和特異蛋白結(jié)合的寡核苷酸序列修飾金納米顆粒，并分別利用PDGF修飾的金納米團(tuán)簇和寡核苷酸修飾的金納米顆粒作為供體和受體，當(dāng)兩者結(jié)合后，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)使其熒光猝滅。Chen等［48］提出了一個簡單的快速利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記檢測細(xì)胞中溶菌產(chǎn)物蛋白質(zhì)的方法。該方法使用谷胱甘肽為模板合成Au NCs，在紫外燈下通過離心就可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的檢測，這種用肉眼就可以觀察，其方法的檢測限達(dá)到了0.75 μM，僅比利用熒光光譜儀檢測的檢測限0.25 μM高出一點。

3 總結(jié)和展望

金納米團(tuán)簇是一種在熒光傳感檢測、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦蜔晒饧{米材料，其作為熒光探針?biāo)宫F(xiàn)出的獨特光學(xué)特性、較低的毒性和超小的尺寸使其在生物分析檢測中有著廣泛的應(yīng)用前景，然而熒光金納米團(tuán)簇的合成機(jī)理和光學(xué)性質(zhì)研究有待進(jìn)一步深化。其合成方法多沿用最初設(shè)計，新方法的報道還很少見，對于金納米團(tuán)簇合成機(jī)理的解釋更少。由于金納米團(tuán)簇合成及其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其與生物檢測物的作用機(jī)理也有待進(jìn)一步探究。

雖然目前對于熒光金納米團(tuán)簇的應(yīng)用和探究尚處于初級階段，但隨著納米技術(shù)的發(fā)展和理論研究的逐步成熟，相信會有更多的多功能、高質(zhì)量的金納米團(tuán)簇脫穎而出，并廣泛應(yīng)用于生物分子的快速、靈敏、特異性的檢測。

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