朱 丹，張春花，習(xí)加喜，梁秋云，劉華鋼＊（.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 500；.廣西百色市人民醫(yī)院，百色 5000；.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 500）

細(xì)胞凋亡（apoptosis）或稱程序性細(xì)胞死亡（PCD）是受基因控制的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺過程，從形態(tài)學(xué)、生化和分子水平上與細(xì)胞壞死有明顯的區(qū)別［1］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞本身主動(dòng)參與的一種生理性調(diào)節(jié)方式，生命有機(jī)體在生長(zhǎng)發(fā)育過程中離不開細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，它們相互協(xié)調(diào)，共同維持正常有機(jī)體的生長(zhǎng)平衡，如果平衡被打破，細(xì)胞凋亡受抑或過度，且機(jī)體不能重新恢復(fù)平衡，將會(huì)導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生，如：腫瘤［2］、艾滋病和動(dòng)脈粥樣硬化和自身免疫性疾病等。課題組前期對(duì)金黃扶正散進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)該方可增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫功能［3－4］，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制時(shí)小鼠的免疫臟器指數(shù)下降，說明免疫抑制時(shí)脾臟的淋巴細(xì)胞減少。因此，本研究擬采用TUNEL法對(duì)金黃扶正散干預(yù)的免疫抑制小鼠脾臟組織進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步觀察小鼠脾細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變并進(jìn)行探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器 光學(xué)顯微鏡（DMR）、病理圖像分析儀（Q550）、721型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、小型染色缸等。

1.2 試藥 金黃扶正散由黃芪、金銀花、大棗、浮小麥組成。制備方法：取金銀花粉碎成細(xì)粉，備用，黃芪、浮小麥、大棗加水煎煮2次，每次1.5h，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.25（70℃）的清膏，加入金銀花細(xì)粉，混勻，烘干，粉碎，分裝（每1g成藥相當(dāng)于生藥材4.01g）?？捡R斯亮藍(lán)（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20110511）；乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20110511）；酸性磷酸酶測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20110514）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（試劑盒含TdT 10×、熒光素標(biāo)記的dUTP 1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP，德國(guó)Roch Applied Sci－enc公司）；Proteinase K工作溶液；TdT酶反應(yīng)液；Streptavidin－HRP溶 液；DAB 工 作 液；SSC 溶 液；H2O2；二甲苯；梯度乙醇（體積分?jǐn)?shù)100%，95%，90%，80%，70%）；蘇木素；甲基綠；雙蒸水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小白鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量13～15g，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2009－2002。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 取小鼠60只，隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為：正常對(duì)照組（生理鹽水灌胃0.02mL·g－1，連續(xù)10d）；環(huán)磷酰胺組（生理鹽水灌胃0.02mL·g－1，連續(xù)10d，同時(shí)隔天皮下注射環(huán)磷酰胺30mg·kg－1）；陽(yáng)性對(duì)照組（每天灌胃左旋咪唑劑25mg·kg－1，連續(xù)10d，給藥后隔天皮下注射環(huán)磷酰胺30mg·kg－1）；金黃扶正散高、中、低劑量組（每天分別灌胃金黃扶正散5.08，2.54和1.27g·kg－1（分別相當(dāng)于臨床劑量的6，12和24倍），連續(xù)10d，給藥后隔天皮下注射環(huán)磷酰胺30mg·kg－1）。

2.2 乳酸脫氫酶（LDH）和酸性磷酸酶（ACP）活性測(cè)定 將脾臟用冰冷的生理鹽水漂洗干凈，放入10mL的離心管內(nèi)，用移液槍取相當(dāng)于每個(gè)組織質(zhì)量的19倍冰冷生理鹽水于離心管中，將離心管置于冰浴中充分勻漿，即可制成5%組織勻漿。將勻漿液以3 000r·min－1離心10min，取上清液備用。按LDH、ACP試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。

2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.3.1 標(biāo)本處理 小鼠處理后，取脾，40mL·L－1多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，采用TUNEL染色法觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)操作 將石蠟組織切片置于染色缸中，用二甲苯浸洗2次，每次10min；用梯度乙醇（體積分?jǐn)?shù)100%，95%，90%，80%，70%）各浸洗1次，每次5min；PBS漂洗2次；用Proteinase K工作液在37°C處理組織15min；PBS漂洗2次；制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50μL TdT＋450μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻。玻片干后，加50μL TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50μL熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在37℃暗濕盒中孵育60min。PBS漂洗3次；可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450～500nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515～565nm）；玻片干后加50μL converter－POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在37℃暗濕盒中孵育30min。PBS漂洗3次；在組織處加50～100μL DAB底物，反應(yīng)15～25℃×10min；PBS漂洗3次；拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

2.3.3 結(jié)果觀察 光鏡下觀察正常細(xì)胞核被染成藍(lán)色，胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀／凋亡小體）。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：200倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，求其平均值。結(jié)合HE染色，選取無(wú)細(xì)胞壞死的5個(gè)視野，用病理圖像分析儀對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)，以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），取5個(gè)視野AI均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠脾臟組織中LDH和ACP活性的影響 與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組可明顯降低LDH和ACP的活性（P＜0.01）；給藥后，金黃扶正散低、中、高劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠的 LDH 活性和 ACP活性（P＜0.01，P＜0.05）。見表1。

表1 金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠脾臟組織中LDH和ACP活性的影響Tab.1 Effects of Jinhuangfuzheng Powders on LDH，ACP activitics of spleen in immunosuppressed mice（±s，n＝10）

表1 金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠脾臟組織中LDH和ACP活性的影響Tab.1 Effects of Jinhuangfuzheng Powders on LDH，ACP activitics of spleen in immunosuppressed mice（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與環(huán)磷酰胺模型組比較△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量／g·kg－1 LDH／U·gprot－1 ACP／U·gprot－1對(duì)照 —10 204.5±1 480.5 288.2±37.7環(huán)磷酰胺 — 8 395.6±1 161.7＊ 239.3±39.9＊左旋咪唑 0.025 9 789.3±645.5△△ 304.5±63.8△金黃扶正散 1.27 9 811.5±1 382.7△ 298.7±58.4△金黃扶正數(shù) 2.54 9 663.2±1 285.6△ 323.5±59.6△△金黃扶正數(shù) 5.08 9 454.9±790.4△ 326.0±47.0△△

3.2 脾細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的改變 見圖1。正常對(duì)照組脾細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞形態(tài)正常。與正常對(duì)照組比較，CTX組可見單個(gè)散在分布的凋亡細(xì)胞，形成凋亡小體，凋亡細(xì)胞胞核著棕黃色或棕褐色，核固縮或染色質(zhì)濃聚附邊；金黃扶正散高、中劑量組凋亡現(xiàn)象較輕，凋亡細(xì)胞較少，金黃扶正散低劑量組凋亡細(xì)胞較中、高劑量組多，有散在凋亡小體。

3.3 對(duì)凋亡指數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，CTX組凋亡指數(shù)顯著性提高（P＜0.05）；金黃扶正散中、高劑量組凋亡指數(shù)與CTX組比較顯著性下降（P＜0.01，P＜0.05）。金黃扶正散低劑量組凋亡指數(shù)與CTX組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見表2。

圖1 實(shí)驗(yàn)各組脾細(xì)胞凋亡觀察結(jié)果（×400）A.對(duì)照組；B.環(huán)磷酰胺組；C.左旋咪唑組；D.金黃扶正散低劑量組；E.金黃扶正散中劑量組；F.金黃扶正散高劑量組Fig.1 The results of spleen cell apoptosis in each group（×400）A.control group；B.CTX group；C.levamisole group；D.Jinhuangfuzheng Powders low group；E.Jinhuangfuzheng Powders middle group；F.Jinhuangfuzheng Powders high group

表2 金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠脾細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響Tab.2 Influence of Jinhuangfuzheng Powders on apoptosis index in immunosuppressed mice （±s，n＝10）

表2 金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠脾細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響Tab.2 Influence of Jinhuangfuzheng Powders on apoptosis index in immunosuppressed mice （±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與環(huán)磷酰胺模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量／g·kg－1 凋亡指數(shù)（AI）對(duì)照 13.20±1.93△環(huán)磷酰胺 21.78±1.22＊陽(yáng)性藥 0.025 13.50±0.97△金黃扶正散 1.27 15.10±0.71金黃扶正散 2.54 13.25±0.90△金黃扶正散 5.08 12.20±0.63△△

4 討論

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是細(xì)胞內(nèi)葡萄糖酵解所必需的酶，其功能是催化乳酸脫氫成為丙酮酸或丙酮酸還原為乳酸，即參與了能量物質(zhì)的有氧氧化與無(wú)氧酵解。LDH活性與巨噬細(xì)胞激活的程度相關(guān)，是巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志之一［5］。酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是高等動(dòng)物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體酶的標(biāo)志，在體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，主要存在于人體的肝臟、脾臟、紅細(xì)胞、骨髓等部位，酸性磷酸酶活性的高低，反映了巨噬細(xì)胞被激活的程度。本研究結(jié)果表明，金黃扶正散對(duì)免疫抑制狀態(tài)下小鼠脾臟LDH和ACP水平有顯著影響，可明顯改善因免疫抑制而引起的小鼠脾臟酸性LDH和ACP水平的下降，提示金黃扶正散可能通過改善巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)提高機(jī)體的免疫功能。

末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法技術(shù)（Terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）－mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’－OH 末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse－radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3－OH形成，很少能夠被染色。因此種方法特異性敏感性強(qiáng)，并且可以量化凋亡細(xì)胞和動(dòng)態(tài)觀察凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，成為它應(yīng)用于凋亡研究的優(yōu)勢(shì)所在［6－9］。

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征是判斷細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)，形態(tài)特征的發(fā)生與凋亡的細(xì)胞內(nèi)生化變化密切相關(guān)［10］。脾臟作為人體重要的外周免疫器官，在機(jī)體體液及細(xì)胞免疫方面發(fā)揮著重要作用。脾按解剖結(jié)構(gòu)分為白髓及紅髓，白髓由密集的淋巴細(xì)胞組成，紅髓由脾索和血竇組成。血液中的病原體及異物經(jīng)血液循環(huán)帶至脾臟，被單核巨噬細(xì)胞過濾清除，或降解為抗原分子后，活化T及B細(xì)胞，進(jìn)行特異免疫應(yīng)答［11］。本實(shí)驗(yàn)中采用TUNEL法檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡情況，觀察金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠脾臟的細(xì)胞凋亡的作用。與正常對(duì)照組比較，CTX組小鼠脾淋巴細(xì)胞的凋亡數(shù)目明顯增多，凋亡細(xì)胞胞核著棕黃色或棕褐色，核固縮或染色質(zhì)濃聚附邊，形成凋亡小體，凋亡指數(shù)有顯著性差異。使用金黃扶正散干預(yù)后，細(xì)胞凋亡數(shù)與模型組相比明顯減少，凋亡小體減少，凋亡現(xiàn)象減輕，能明顯改善免疫抑制小鼠脾細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，使脾臟淋巴細(xì)胞凋亡維持在低水平。

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