羅 艷，焦 楊，邱 莉，方 芳，謝集照，謝 婷（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

廣西瑤藥雞爪風(fēng)（Desmos chinensis Lour.）為番荔枝科（Annonaceae）假鷹爪屬（Desmos Lour.）植物，又名碎骨王、雞香木、雞爪木、假鷹爪、酒餅藤。雞爪風(fēng)作為民間習(xí)用藥材具有悠久歷史，最早記載于《嶺南采藥錄》，其味辛，性溫，有小毒，歸脾、肝經(jīng)；行氣消滯，祛風(fēng)止痛，殺蟲；用于治療消化不良、產(chǎn)后腹痛、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、瘧疾、水腫、魚骨梗喉、疥癬等［1－3］，在我國主要分布在廣東、廣西、云南和貴州等地［4］?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，雞爪風(fēng)所屬的假鷹爪屬植物具有抗腫瘤、抗艾滋病毒（HIV）、抗氧化、抗菌、強(qiáng)心、抑制芳香酶和脂肪氧化酶、抑制活化T細(xì)胞核因子（NFAT）轉(zhuǎn)錄等多種生物活性［5］。筆者研究雞爪風(fēng)提取物在體外對4種不同人肝癌細(xì)胞株增殖的影響，以期為進(jìn)一步深入研究雞爪風(fēng)抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 FD－1D－50真空冷凍干燥器（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；1450型無菌超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備總廠）；3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fischer）；MK3 型 酶 標(biāo) 儀 （美 國 Thermo MULTISKAN公司）；CKX－41型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；TDL－5A型低速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；AB204－N電子分析天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司）；DW86L621超低溫冰箱（海爾公司）。

1.2 試藥 RPMI1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號(hào)NYC0834）；DMEM 培養(yǎng)液（美國 Hyclone公司，批號(hào)NYD0844）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號(hào)130624）；MTT（北京Solarbio公司，批號(hào)0739）；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶－EDTA（北京Solarbio公司，批號(hào)20130712）；DMSO（北京Solarbio公司，批號(hào)302A037）。雞爪風(fēng)，采自廣西梧州市岑溪縣，經(jīng)廣西食品藥品檢驗(yàn)所韋家福主任中藥師鑒定為番荔枝科 （Annonaceae）假 鷹 爪 屬 （Desmos Lour.）雞 爪 風(fēng)（Desmos chinensis Lour.）的莖葉。藥材留樣編號(hào)為JZF20121010，現(xiàn)保存于廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室。

1.3 細(xì)胞株 肝癌 HCC－LM3、BEL－7404、SMMC－7721、HepG2細(xì)胞株，由廣西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供并傳代培養(yǎng)。

2 方法

2.1 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物的制備 10kg雞爪風(fēng)樣品，用10倍量體積分?jǐn)?shù)85%乙醇滲漉提取3次，合并3次提取液，減壓濃縮，制成體積分?jǐn)?shù)85%乙醇總提取物浸膏。提取物經(jīng)真空冷凍干燥，取適量提取物溶解于PBS緩沖液中，配成2mg·mL－1儲(chǔ)備液，濾膜（0.22μm）過濾，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將BEL－7404、SMMC－7721、HepG2和HCC－LM3細(xì)胞于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的條件下培養(yǎng)，其中 BEL－7404、SMMC－7721、HepG2細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，HCC－LM3細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每天觀察細(xì)胞生長情況及細(xì)胞密度，并及時(shí)換液和傳代，維持細(xì)胞正常生長，保持良好的細(xì)胞狀態(tài)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 A組（藥物組）：雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物藥液，設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度組，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)平行孔。以質(zhì)量濃度為0.8，0.4，0.2，0.1和0.05mg·mL－1體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物分別對HCC－LM3、BEL－7404細(xì)胞作用24和48h。以質(zhì)量濃度為0.5，0.25，0.125，0.075和0.037 5mg·mL－1體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物分別對SMMC－7721、HepG2細(xì)胞作用24和48h。B組（不同質(zhì)量濃度的體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物本底值組）：本底值組，不加MTT，只加培養(yǎng)基和不同質(zhì)量濃度藥物，共5個(gè)質(zhì)量濃度組。C組：陰性對照組（不加藥物）。

2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 按上述實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)后，不同質(zhì)量濃度的雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取 物 分 別 作 用 HCC－LM3、BEL－7404 和 SMMC－7721、HepG2細(xì)胞24h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。

2.5 MTT 法測定［6－8］取對數(shù)生長期的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS液輕微洗滌細(xì)胞2～3次；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，在倒置顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×104～5×104個(gè)·mL－1，每孔加100μL細(xì)胞懸液，均勻地接種于96孔培養(yǎng)板中。將接種后的培養(yǎng)板移入CO2孵箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長。之后A組每孔加入100μL配制好的不同質(zhì)量濃度的藥液；B組每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基；C組為對照組，加入100μLPBS液。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24和48h后，加藥組A組和對照組C組每孔加入20μL 5g·L－1MTT溶液，本底值組B組不加MTT只加無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清，A組和C組每孔加入200μLDMSO，B組每孔加100μL不同質(zhì)量濃度藥物和100μLDMSO，15min內(nèi)于492nm波長處測定吸光度（A）值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響 藥物處理肝癌細(xì)胞24h后，倒置顯微鏡下觀察，對照組細(xì)胞生長較活躍，細(xì)胞貼壁生長，呈多邊形、異型性明顯。而加藥組細(xì)胞生長較緩慢，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞體積變小、變圓、有脫落，隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，死亡細(xì)胞多見。見圖1。

圖1 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the morphologies of four human hepatoma cell lines

3.2 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對肝癌細(xì)胞增殖的影響 與陰性對照組相比較，結(jié)果見表1～表4。不同質(zhì)量濃度體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物處理HCC－LM3、BEL－7404、SMMC－7721和 HepG2肝癌細(xì)胞24和48h后，均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，作用隨質(zhì)量濃度的增加而增大；相同質(zhì)量濃度雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物處理上述4種肝癌細(xì)胞不同的時(shí)間時(shí)，其抑制作用隨用藥時(shí)間的延長而增強(qiáng)，呈時(shí)間和劑量－效應(yīng)依賴關(guān)系。

表1 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對HCC－LM3細(xì)胞增殖的影響Tab.1 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of HCC－LM3cell line（±s，n＝3）

表1 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對HCC－LM3細(xì)胞增殖的影響Tab.1 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of HCC－LM3cell line（±s，n＝3）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 質(zhì)量濃度／mg·mL－1 24h A 抑制率／%48h A 抑制率／%對照組 — 0.510±0.029 — 0.723±0.009—47.02藥物組 0.8 0.188±0.046＊＊ 63.14 0.008±0.010＊＊ 98.89 0.4 0.344±0.038＊＊ 32.55 0.118±0.013＊＊ 83.68 0.2 0.370±0.041＊＊ 27.45 0.251±0.018＊＊ 65.28 0.1 0.413±0.004＊＊ 19.02 0.367±0.027＊＊ 49.24 0.05 0.450±0.008＊ 11.76 0.383±0.015＊＊

表2 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對BEL－7404細(xì)胞增殖的影響Tab.2 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of BEL－7404cell line（±s，n＝3）

表2 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對BEL－7404細(xì)胞增殖的影響Tab.2 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of BEL－7404cell line（±s，n＝3）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 質(zhì)量濃度24h48h／mg·mL－1A 抑制率／%A 抑制率／%對照組 — 0.386±0.002 — 0.776±0.038—藥物組 0.8 0.100±0.014＊＊ 74.09 0.146±0.010＊＊ 81.19 10.31 0.4 0.278±0.001＊＊ 27.98 0.449±0.010＊＊ 42.14 0.2 0.347±0.047 10.10 0.597±0.005＊＊ 23.07 0.1 0.354±0.022 8.29 0.656±0.015＊＊ 15.46 0.05 0.376±0.027 2.59 0.696±0.033＊

表3 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對SMMC－7721細(xì)胞增殖的影響Tab.3 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of SMMC－7721cell line（±s，n＝3）

表3 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對SMMC－7721細(xì)胞增殖的影響Tab.3 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of SMMC－7721cell line（±s，n＝3）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 質(zhì)量濃度24h48h／mg·mL－1A 抑制率／%A 抑制率／%對照組 — 0.757±0.016 — 1.056±0.004—藥物組 0.5 0.352±0.005＊＊ 53.50 0.329±0.006＊＊ 68.84 11.55 0.25 0.612±0.017＊＊ 19.15 0.562±0.009＊＊ 46.78 0.125 0.666±0.032＊ 12.02 0.796±0.005＊＊ 24.62 0.075 0.729±0.014 3.70 0.894±0.009＊＊ 15.34 0.037 5 0.739±0.016 2.38 0.934±0.014＊＊

表4 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對HepG2細(xì)胞增殖的影響Tab.4 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of HepG2cell line（s，n＝3）

表4 雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對HepG2細(xì)胞增殖的影響Tab.4 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of HepG2cell line（s，n＝3）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 質(zhì)量濃度24h48h／mg·mL－1A 抑制率／%A 抑制率／%對照組 — 0.601±0.016 — 0.779±0.010—藥物組 0.5 0.350±0.009＊＊ 41.76 0.436±0.011＊＊ 44.03 13.35 0.25 0.455±0.016＊＊ 24.29 0.521±0.015＊＊ 33.12 0.125 0.521±0.001＊＊ 13.31 0.616±0.040＊ 20.92 0.075 0.565±0.011＊ 5.99 0.633±0.014＊＊ 18.74 0.037 5 0.605±0.019 — 0.675±0.028＊＊

4 討論

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，按來源將其分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌。其中原發(fā)性肝癌臨床上以肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為主，約占原發(fā)性肝癌的80%～90%［9］。多激酶抑制劑如索拉非尼、舒尼替尼在臨床上用于治療中晚期HCC［10］。目前，各種靶向酪氨酸激酶受體細(xì)胞信號(hào)通路的抑制劑或抗體是抗肝癌藥物的研究熱點(diǎn)，其中一些有潛力的候選藥物已經(jīng)進(jìn)入到臨床試驗(yàn)的階段［10］，從天然產(chǎn)物中尋找蛋白酪氨酸激酶抑制劑是發(fā)現(xiàn)抗肝癌新藥的一個(gè)重要途徑［11］，近年來文獻(xiàn)報(bào)道的天然產(chǎn)物中蛋白酪氨酸激酶抑制劑按其結(jié)構(gòu)類型包括酚類、醌類、生物堿、甾醇等。多酚類化合物黃酮類如牡荊素、桑色素、兒茶素和染料木素等具有多重抗腫瘤效應(yīng)，如：抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤侵襲等，但是，黃酮類化合物因來源不同、結(jié)構(gòu)不同，表現(xiàn)出的生物活性差異很大［12］。番荔枝科（Annonaceae）植物富含生物堿、萜類、黃酮、番荔素、多氧環(huán)己烯和苯乙烯內(nèi)酯等植物化學(xué)成分，其中的番荔素、多氧環(huán)己烯和苯乙烯內(nèi)酯等類型化合物具有極好的抗腫瘤活性，因此，對番荔枝科植物的化學(xué)成分研究是當(dāng)前國內(nèi)外繼紅豆杉之后的又一抗腫瘤新藥研發(fā)熱點(diǎn)［13］。文獻(xiàn)報(bào)道，番荔枝科假鷹爪屬植物的某些植物化學(xué)成分在體外表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，如desmosdumotin C對多種腫瘤細(xì)胞，如HOS、MCF－7、IA9、HCT－8、KB、KB－VIN 等具有明顯的抑制作用［14］。desmosflavan A和desmosflavan B對癌細(xì)胞 HuCCA－1、HepG2、A549、MOLT－3等有細(xì)胞毒作用，其中desmosflavan A對癌細(xì)胞的抑制效果顯著，IC50分別為2.25，3.75，2.45和0.29μg·mL－1；desmosflavan B的IC50分別為22.0，20.3，27.0和1.71μg·mL－1［15］?；衔颿hinendihydrochalcone對癌細(xì)胞MOLT－3具有抑制活性（IC50為7.16μg·mL－1）［16］。

廣西瑤藥雞爪風(fēng)（Desmos chinensis Lour.）為番荔枝科（Annonaceae）假鷹爪屬（Desmos Lour.），本實(shí)驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)85%乙醇滲漉提取其總成分，并選用4種不同人肝癌細(xì)胞株 HCC－LM3、BEL－7404、SMMC－7721、HepG2為研究對象，通過MTT比色法觀察雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物對上述細(xì)胞體外增殖的影響。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的雞爪風(fēng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇提取物均可抑制人肝癌細(xì)胞HCCLM3、BEL－7404、SMMC－7721、HepG2增殖，在質(zhì)量濃度達(dá)到0.2mg·mL－1以上時(shí)，對人肝癌細(xì)胞HCC－LM3、BEL－7404、SMMC－7721、HepG2的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，其體外增殖的抑制作用與其質(zhì)量濃度和作用時(shí)間相關(guān)，呈劑量與時(shí)間效應(yīng)依賴性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，廣西瑤藥雞爪風(fēng)抗肝癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制值得深入研究。

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