張秉華，馬雯霞，王 發(fā)（.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安 7006；.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，西安 70038）

硝酸咪康唑?yàn)檫溥蝾?lèi)廣譜抗真菌藥，其對(duì)五官、陰道、皮膚等部位的真菌感染均有效，臨床上主要用于治療深部真菌病。硝酸咪康唑通過(guò)抑制真菌細(xì)胞膜的固醇合成、影響細(xì)胞膜的通透性，從而抑制真菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致真菌死亡。其在4μg·mL－1的質(zhì)量濃度下對(duì)新型隱球菌、假絲酵母菌和粗孢子菌均呈敏感反應(yīng)，可抑制大部分臨床分離的真菌，并且對(duì)金葡菌和鏈球菌及革蘭陽(yáng)性球菌和炭疽菌等也有一定抗菌作用［1］。結(jié)合硝酸咪康唑原料合成、純化工藝中用到的有機(jī)溶劑，并參考《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄殘留溶劑測(cè)定法的指導(dǎo)原則［2］及有關(guān)文獻(xiàn)［3－9］，決定對(duì)硝酸咪康唑原料中可能殘留的丙酮和甲苯建立相應(yīng)的氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定，并使用建立的方法測(cè)定了國(guó)內(nèi)原料生產(chǎn)企業(yè)的3批硝酸咪康唑原料的殘留有機(jī)溶劑水平。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，以N，N－二甲基甲酰胺為溶劑的殘留溶劑氣相色譜測(cè)定方法，簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 6890N氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器；全自動(dòng)空氣源SPB－3型（北京中惠普分析技術(shù)研究所）。

1.2 試藥 硝酸咪康唑原料由廣東順?lè)逅帢I(yè)有限公司提供，批號(hào)為20071101，20071102，20071103。丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)為T(mén)20110214）和甲苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)為20100203），均為分析純。N，N－二甲基甲酰胺為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)為11060005）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.1.1 確定樣品中所涉及的殘留溶劑種類(lèi) 通過(guò)企業(yè)提供的硝酸咪康唑原料生產(chǎn)工藝中涉及的有機(jī)溶劑，并結(jié)合《中國(guó)藥典》2010年版中規(guī)定應(yīng)控制的溶劑，初步確定控制硝酸咪康唑原料中的二類(lèi)溶劑甲苯和三類(lèi)溶劑丙酮。并且選擇等溫條件，通過(guò)新建立的氣相色譜方法，將樣品質(zhì)量濃度由0.1g·mL－1提高至0.2g·mL－1后進(jìn)樣，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)其他殘留有機(jī)溶劑色譜峰。通過(guò)上述預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定硝酸咪康唑中控制的殘留溶劑為甲苯和丙酮。

2.1.2 氣相色譜檢測(cè)方法的建立

2.1.2.1 色譜柱的選擇 通過(guò)比較不同填料及材質(zhì)的填充柱（玻璃柱和不銹鋼柱）和不同極性的石英毛細(xì)管色譜柱，待測(cè)組分在高分子多孔小球不銹鋼（或玻璃）填充柱中各組分分離效果也較好，但峰形較寬，柱效偏低。若選擇非極性和中等極性的毛細(xì)管柱則分離情況不如DB WAX（PEG－20M）的極性石英毛細(xì)管柱。故最終選擇 DB WAX（PEG－20M）石英毛細(xì)管柱。

2.1.2.2 溶劑的選擇 由硝酸咪康唑的溶解性可知，其在水中幾乎不溶，易溶于N，N－二甲基甲酰胺。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選用N，N－二甲基甲酰胺做溶劑，樣品與對(duì)照品均溶解完全，且硝酸咪康唑在N，N－二甲基甲酰胺中溶解度較大，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.1g·mL－1時(shí)仍為真溶液狀態(tài)（可以很好地提高方法的檢測(cè)限）。并且N，N－二甲基甲酰胺溶劑本身對(duì)本實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾。

2.1.2.3 優(yōu)化色譜條件 在60℃等溫條件下各待測(cè)組分及溶劑均能夠很好分離，但N，N－二甲基甲酰胺峰保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同時(shí)考慮樣品中可能的殘留，選擇待測(cè)組分分離后對(duì)色譜柱進(jìn)行程序升溫。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)最終選擇的色譜條件為：進(jìn)樣口溫度為200℃；檢測(cè)器為FID，檢測(cè)器溫度為250℃；載氣為氮?dú)猓簧V柱為PEG－20M 毛細(xì)柱（30m×0.25mm，0.25μm），柱溫為程序升溫，初始溫度60℃，保持3min，再以30℃·min－1的升溫速率升至185℃，保持20min。經(jīng)優(yōu)化過(guò)的色譜條件，各組分分離良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 氣相色譜圖a.空白溶液；b.樣品；c.對(duì)照品；1.丙酮；2.甲苯；3.N，N－二甲基甲酰胺Fig.1 GC chromatogramsa.blank solution；b.sample；c.reference substances；1.acetone；2.toluene；3.N，N－dimethylformamide

2.2 線性關(guān)系考察 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取丙酮、甲苯2種有機(jī)溶劑各適量，用N，N－二甲基甲酰胺制成含丙酮5mg·mL－1、甲苯0.89mg·mL－1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液5mL，置于50mL量瓶中，用N，N－二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，加N，N－二甲基甲酰胺稀釋制成含丙酮0.25～1.0mg·mL－1和甲苯0.044 5～0.178mg·mL－1的系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液。按上述氣象色譜方法進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），建立線性回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab.1 Linear range and regression equations of calibration curves

2.3 檢測(cè)限與定量限 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取不同體積并逐步稀釋?zhuān)瓷鲜錾V方法進(jìn)樣并測(cè)定，當(dāng)所測(cè)殘留溶劑的信噪比達(dá)到要求時(shí)，丙酮、甲苯檢測(cè)限（S／N＝3）分別為0.002 5和0.000 445mg·mL－1；定量限（S／N＝10）分別為0.005和0.000 89mg·mL－1。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液依照建立的氣相色譜方法測(cè)定，重復(fù)5次進(jìn)樣，通過(guò)5次測(cè)定的峰面積進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果所測(cè)5次丙酮、甲苯峰面積的RSD分別為0.9%和1.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取已知溶劑含量的硝酸咪康唑原料作為供試品，精密稱(chēng)定供試品5g，置于50mL量瓶中，精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0mL，用N，N－二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，制備成重復(fù)性實(shí)驗(yàn)樣品溶液，通過(guò)3d連續(xù)按照上述氣相色譜方法重復(fù)測(cè)定樣品中各有機(jī)溶劑的量，3d的測(cè)定結(jié)果分別為：丙酮加樣回收率為99.9%，101.5%和100.5%；甲苯加樣回收率為101.2%，98.6%和99.7%。日間重復(fù)性的2組分回收數(shù)據(jù)表明，本色譜方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知溶劑含量的硝酸咪康唑原料作為供試品，分別精密稱(chēng)定9份供試品5g，分別置于50mL量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0，5.0和6.0mL，每個(gè)質(zhì)量濃度各加3份（共9份），用N，N－二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，制得相當(dāng)于檢查限度3個(gè)水平（80%，100%，和120%）的溶液。依照上述的氣相色譜方法測(cè)定并計(jì)算回收率。3個(gè)水平的回收率測(cè)定結(jié)果分別為：低水平丙酮和甲苯回收率分別為100.9%和98.9%，中水平丙酮和甲苯回收率分別為100.2%和101.1%，高水平丙酮和甲苯回收率分別為99.8%和99.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本色譜方法回收率良好。

2.7 硝酸咪康唑樣品的測(cè)定 分別取硝酸咪康唑原料約1g，精密稱(chēng)定，置于10mL量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液，按照上述氣相色譜方法進(jìn)行測(cè)定，2種殘留溶劑丙酮和甲苯均有檢出，但其殘留溶劑量均小于《中國(guó)藥典》2010年版二部中所規(guī)定的限度（丙酮的限度0.5%、甲苯的限度0.089%）。廣東順?lè)逅帢I(yè)有限公司的3批硝酸米康唑原料殘留溶劑測(cè)定結(jié)果分別為：丙酮?dú)埩舴謩e為0.006 2%，0.007 5%和0.006 5%；甲苯殘留分別為0.008 9%，0.009 3%和0.009 0%。

3 討論

本方法快速，準(zhǔn)確，樣品制備簡(jiǎn)便，對(duì)硝酸咪康唑原料中的丙酮和甲苯殘留溶劑能夠有效控制。但考慮到不同生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)工藝有可能存在不同，在原料的合成與純化過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑種類(lèi)也可能并不一致。所以本方法在針對(duì)特定殘留溶劑的測(cè)定時(shí)，具有很大的不確定性。最好的解決方法應(yīng)當(dāng)是結(jié)合各生產(chǎn)企業(yè)具體的生產(chǎn)工藝，并廣泛收集樣品，在考察不同的原料生產(chǎn)企業(yè)的不同樣品的具體情況下，建立相應(yīng)的多種溶劑檢出方法，這樣可以有效地避免殘留溶劑的漏檢情況。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典臨床用藥須知：化學(xué)藥與生物制品卷［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1337－1338.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2010年版［S］.二部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄61－65.

［3］ICH指導(dǎo)委員會(huì).藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求（質(zhì)量部分）［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：79－100.

［4］石濤，陳振德.頂空氣相色譜法測(cè)定制劑包衣中乙醇和二氯甲烷殘留量［J］.西北藥學(xué)雜志，2009，24（4）：251－252.

［5］秦立，胡昌勤.氣相色譜保留時(shí)間預(yù)測(cè)在藥品殘留溶劑中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2000，26（10）：1469－1471.

［6］李婕，黃海，偉張紅.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定來(lái)氟米特有機(jī)溶劑殘留量［J］.西北藥學(xué)雜志，2010，25（1）：3－4.

［7］張靜，徐三能.頂空氣相色譜法測(cè)定比阿培南的有機(jī)溶劑殘留量［J］.安徽醫(yī)藥，2011，32（1）：36－38.

［8］李祥勝，楊瑾.氣相色譜法測(cè)定恩替卡韋原料藥中有機(jī)溶劑殘留量［J］.安徽醫(yī)藥，2012，33（11）：1594－1596.

［9］王發(fā)，徐春燕，王嫦鶴，等.頂空氣相色譜法測(cè)定聚桂醇中環(huán)氧乙烷和二氧六環(huán)的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2013，34（1）：33－34.