范步高，戴騰順

(上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司，上海 201506)

丹參滴注液一測(cè)多評(píng)法可行性研究

范步高*，戴騰順

(上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司，上海 201506)

目的評(píng)估將一測(cè)多評(píng)法(QAMS)應(yīng)用于檢測(cè)丹參滴注液多指標(biāo)含量的可行性。方法采用回顧性研究和Excel模型處理法，建立QAMS的“最優(yōu)”一元線(xiàn)性方程，并用相對(duì)偏差、t檢驗(yàn)、相關(guān)系數(shù)、相似度等評(píng)價(jià)方法對(duì)方程的預(yù)測(cè)值(QAMS計(jì)算值：y預(yù)測(cè))與實(shí)測(cè)值(常規(guī)法實(shí)測(cè)值：y實(shí)測(cè))的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)、比較和篩選。結(jié)果在甄別和剔除異常數(shù)據(jù)的前提下，以?xún)煞N不同方法來(lái)源的相對(duì)校正因子f丹參素鈉/原兒茶醛為斜率的“最優(yōu)”一元線(xiàn)性方程，其y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，平均相對(duì)偏差也均小于5%，表明QAMS的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。結(jié)論QAMS應(yīng)用于丹參滴注液含量檢測(cè)，更能體現(xiàn)生產(chǎn)所需的簡(jiǎn)便、低成本的特點(diǎn)，可以作為除丹參滴注液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定之外的一種新的含量檢測(cè)方法。

一測(cè)多評(píng)法；相對(duì)校正因子；異常值檢驗(yàn)；質(zhì)量控制；Excel；丹參滴注液

中藥與化學(xué)藥的最大區(qū)別在于單味中藥的復(fù)方性，即單味中藥即能協(xié)同本身所具有的多種有效成分發(fā)揮出最佳的藥用療效，所以，中藥的質(zhì)量與提取工藝息息相關(guān)的根本是為控制其有效成分的“質(zhì)”與“量”的相對(duì)穩(wěn)定性。目前現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一般是用相應(yīng)的對(duì)照品對(duì)各重要指標(biāo)成分的含量逐一進(jìn)行檢測(cè)，或因其對(duì)照品穩(wěn)定性較差難以獲得而免予檢測(cè)，故較大制約了中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的整體提高。為解決這一問(wèn)題，現(xiàn)已有較多學(xué)者研究并撰文提供了內(nèi)標(biāo)多控法、替代對(duì)照品法、系統(tǒng)內(nèi)標(biāo)法、加校正因子的主成分對(duì)照法、一測(cè)多評(píng)法(QAMS)等新的測(cè)定方法[1-3]。筆者以丹參滴注液為實(shí)例，對(duì)QAMS的可行性進(jìn)行回顧性研究和驗(yàn)證。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(安捷倫1100)。

丹參滴注液及中間品(上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司)，丹參素鈉對(duì)照品(批號(hào)：110855-200809)、原兒茶醛對(duì)照品(批號(hào)：110810-201007)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，5-羥甲基糠醛對(duì)照品(批號(hào)：102k3450，SIGMA，含量為99%)。

2 檢測(cè)方法

丹參素鈉、原兒茶醛含量測(cè)定及5-羥甲基糠醛限度檢查，依據(jù)丹參滴注液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行測(cè)定(外標(biāo)一點(diǎn)法)。

3 QAMS研究

3.1 原理

QAMS等諸多新法盡管名稱(chēng)各異，但若究其原理則基本相同，均是將HPLC法的A、B成分相對(duì)校正因子fBA(下標(biāo)BA表示B對(duì)A的相對(duì)性，下同)視為常數(shù)。假設(shè)f、c、s分別表示校正因子、濃度、峰面積；下標(biāo)A、B或Ar、Br分別表示樣品或?qū)φ掌稟、B成分。在對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，A濃度按常規(guī)法檢測(cè)：cA=sA·cAr/sAr，B濃度則(省略對(duì)照品)通過(guò)fBA進(jìn)行計(jì)算：cB=fBA·sB·cA/sA，所不同的僅是求取fBA的計(jì)算方法。

對(duì)于fBA，常用的計(jì)算方法主要分為兩種：一種是標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，即應(yīng)用B、A標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率比值求得fBA；另一種是平均值法，即以不同進(jìn)樣量測(cè)得B、A的fB、fA的平均值之比作為fBA[5-6]。本次研究則采用直接對(duì)cBA～sBA進(jìn)行線(xiàn)性回歸的方法，將得到的斜率作為fBA進(jìn)行QAMS計(jì)算。

3.2 數(shù)據(jù)采集

采用回顧性研究，將原兒茶醛設(shè)定為成分A(價(jià)格相對(duì)便宜)，丹參素鈉為成分B，按時(shí)間順序采集近期供試品(丹參滴注液樣品按10倍量稀釋)含量檢測(cè)結(jié)果(cB、cA，計(jì)量單位μg·mL-1)及相應(yīng)的峰面積(sB、sA)，分別計(jì)算cBA=cB/cA及sBA=sB/sA，共計(jì)26組數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1。

表1 丹參滴注液樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)

注：加框序號(hào)組數(shù)據(jù)經(jīng)后續(xù)檢驗(yàn)甄別為異常數(shù)據(jù)

3.3 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果

對(duì)采集的26組cBA～sBA數(shù)據(jù)，分別進(jìn)行零截距和非零截距線(xiàn)性回歸，得到方程Y0：cBA=fBA0·sBA和Y1：cBA=fBA1·sBA+a。

fBA0或fBA1及a等回歸統(tǒng)計(jì)值可以通過(guò)Excel的函數(shù)得到[7]：將cBA～sBA數(shù)據(jù)輸入Excel中，在空白處選中5行2列，輸入“=LINEST(cBA數(shù)據(jù)區(qū)域，sBA數(shù)據(jù)區(qū)域，TRUE或FALSE，1)”公式，(shift+ctrl+enter)三鍵確認(rèn)。一元線(xiàn)性回歸統(tǒng)計(jì)值返回格式見(jiàn)表2，而P值則可在某一單元格中輸入“=FDIST(F值，1，n-2)”得到。

表2 LINEST函數(shù)返回一元線(xiàn)性回歸統(tǒng)計(jì)值

注：括號(hào)中的數(shù)對(duì)即為統(tǒng)計(jì)值數(shù)組中的行、列號(hào)

表3 一元回歸模型線(xiàn)性比較

表4 一元回歸模型QAMS計(jì)算結(jié)果比較

注：Pt表示y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)的配對(duì)t檢驗(yàn)P值；r表示y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)的相關(guān)系數(shù)；Q表示y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)的相似度；Q*表示y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)的改良相似度。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表5 丹參滴注液樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)

表6 一元回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)QAMS計(jì)算結(jié)果比較

4 討論

4.1 QAMS的準(zhǔn)確性控制

QAMS的準(zhǔn)確性主要依賴(lài)于一元回歸模型線(xiàn)性顯著、樣本數(shù)據(jù)無(wú)異常值、A成分測(cè)定處于“穩(wěn)態(tài)”(統(tǒng)計(jì)控制狀態(tài))、B等待測(cè)成分色譜峰的準(zhǔn)確定位。

4.1.1 一元線(xiàn)性回歸模型的顯著性檢驗(yàn) 線(xiàn)性回歸模型的顯著性檢驗(yàn)，針對(duì)不同的目的可分別采用相關(guān)系數(shù)r檢驗(yàn)、回歸系數(shù)b檢驗(yàn)、整體模型檢驗(yàn)。但對(duì)于類(lèi)似y=a+bx一元回歸模型，3種檢驗(yàn)效果具有等價(jià)性，即只要任選其一進(jìn)行檢驗(yàn)即可達(dá)到3種不同的檢驗(yàn)?zāi)康腫8]。本次研究采用對(duì)整體模型進(jìn)行F檢驗(yàn)，結(jié)果各方程的線(xiàn)性關(guān)系均非常顯著(P<0.01)。

對(duì)異常值的檢驗(yàn)，通常有格羅布斯檢驗(yàn)法、迪克遜檢驗(yàn)法和t檢驗(yàn)法等[9]。本次研究則采用t檢驗(yàn)法，即檢驗(yàn)回歸模型的y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)的絕對(duì)殘差值是否大于α水平臨界值ξ，若是，即可將其判定為異常值。對(duì)于y=a+bx回歸模型，假定x=x條件下的隨機(jī)變量y～N(a+bx，σ2)，ξ的計(jì)算公式[10]如下：

(1)

式中：tα(n-2)為自由度為(n-2)、置信水平(1-α)的t分布雙尾臨界值，可以通過(guò)查表或在Excel單元格中輸入“=TINV(α，n-2)”求得。

4.1.3 A成分的檢測(cè)結(jié)果“穩(wěn)態(tài)”檢驗(yàn) QAMS在求得fBA進(jìn)行常規(guī)樣品檢測(cè)時(shí)，只對(duì)A對(duì)照品溶液附加檢測(cè)，故其他待測(cè)成分計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性將完全依賴(lài)于A檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以對(duì)A的檢測(cè)結(jié)果是否處于“穩(wěn)態(tài)”(受控狀態(tài))需及時(shí)加以關(guān)注和檢驗(yàn)。方法可類(lèi)似4.1.2對(duì)cA～sA或cBA～sBA數(shù)據(jù)建立(1-α)的殘差置信區(qū)間，也可以直接對(duì)fA進(jìn)行檢驗(yàn)，并對(duì)甄別的異常偏差進(jìn)行分析、復(fù)測(cè)等處理。

4.1.4 B成分(丹參素鈉)色譜峰的定位 待測(cè)成分色譜峰的準(zhǔn)確定位一般采用的是相對(duì)保留值RtBA=tB/tA、保留時(shí)間差ΔtBA=tB-tA[1-3]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，RtBA的RSD相對(duì)較小，故可選作B峰的主要定位依據(jù)。

4.2 相對(duì)校正因子評(píng)價(jià)方法

對(duì)于t檢驗(yàn)法，似乎不能僅對(duì)原始數(shù)據(jù)線(xiàn)性回歸所得的y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)在一定的顯著性水平上有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而決定是否可將fBA0或fBA1用于QAMS計(jì)算。對(duì)于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)或新的檢測(cè)數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)法對(duì)y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)的差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義判定結(jié)果則與QAMS對(duì)fBA0或fBA1的穩(wěn)定性要求較為吻合。

Pt計(jì)算可以通過(guò)在Excel單元格中輸入“=TTEST(y實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)區(qū)域，y預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)區(qū)域，2，1)”求得。若Pt>0.05，即可判定y預(yù)測(cè)與y實(shí)測(cè)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.05)。

fBA0、fBA1均可用于QAMS計(jì)算，但fBA0則更顯簡(jiǎn)單、合理，且可以直接通過(guò)fBA0計(jì)算供試品B成分濃度(cB=fBAO·fAr·sB或cB=fBAO·sBA·cA)。

4.3 QAMS在限量檢測(cè)中的應(yīng)用

丹參滴注液中的等滲調(diào)節(jié)劑為葡萄糖，在高溫滅菌過(guò)程中較易分解產(chǎn)生5-羥甲基糠醛有害物(假設(shè)其為K成分)，所以質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)K成分進(jìn)行限度檢查：sK∶sKr<0.5，cKr=2.5 μg·mL-1。即要求供試品cK<1.25 μg·mL-1(折算成丹參滴注液樣品K成分濃度<12.5 μg·mL-1)。

由cKA=fKA·sKA可得sKA=cK/(fKA·cA)，所以，sKA<1.25/(fKA·cA)=2.27/cA即可認(rèn)為符合限量規(guī)定(fKA≈0.55，RtKA≈0.40，ΔtKA≈16.08)。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)546批丹參滴注液樣品K的檢測(cè)結(jié)果，平均值1.17 μg·mL-1，但大于5.0 μg·mL-1僅1批(最大值5.06 μg·mL-1)，相當(dāng)于12.5 μg·mL-1規(guī)范限的40%。所以，據(jù)此可以設(shè)定安全系數(shù)極高的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)：sKA<0.5/(fKA·cA)=0.91/cA。

一般情況下，企業(yè)生產(chǎn)的藥品均應(yīng)按《中國(guó)藥典》(2010版)或國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)，但《中國(guó)藥典》(2010版)也并未完全否定采用其他的可行方法，只是要求應(yīng)將該方法與規(guī)定的方法進(jìn)行比較試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果掌握使用[13]。QAMS不僅可應(yīng)用于中藥新藥的多成分質(zhì)量研究，也適用于企業(yè)對(duì)多成分中藥類(lèi)上市產(chǎn)品，特別是對(duì)其中間產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)成本也可大大降低。所以，QAMS是值得推廣應(yīng)用的科學(xué)測(cè)定法。

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TheFeasibilityResearchofQAMSofSalviamiltiorrhizaInjection

FANBugao*，DAITengshun

(ShanghaiTreefulPharmaceuticalCo.，Ltd.，Shanghai201506，China)

Objective：Assess the feasibility of QAMS using in analyzing the parameters ofSalviamiltiorrhizainjecting.MethodsSet up‘the optimal’ linear equation in one unknown of QMAS with retrospective study and Excel model approaches，check and compare the observable differences between predicated result(QAMS calculation result ypredict)and actual result(normal actual test yactual test)with relative deviation，t-test，correlation coefficient，similarity degree ect evaluation ways.ResultsThe condition of screening and getting rid of abnormal data，there is no statistically significant difference between the results of the content of Slavonic acid A sodium both ypredictand yactual testcalculated by ‘the optimal’ linear equation in one unknown slope as relative correction factorfSlavonic acid A sodium/protocatechualdehydesourced all kinds of methods，the average relative deviation are all less than 5%，which proves QMAS is exact and reliable to the content of Slavonic acid A sodium.ConclusionIt is reflected more convenient and low cost characteristics inSalviamiltiorrhizainjecting producing that QAMS use for analyzing the contents ofSalviamiltiorrhizainjecting，it is a inspection method that beyondSalviamiltiorrhizainjection’s quality standard rules also.

Quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)；Relation correction factor(RCF)；Outlier test；Quality control；Excel；Salviamiltiorrhizainjection

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范步高，工程師，研究方向：藥品生產(chǎn)工藝、技術(shù)研發(fā)；E-mail：fanbugao@treeful.com.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.016

2013-05-06)