唐悅玲， 李小靜， 陳 釗, 洪學(xué)哲， 馬 莉

瘢痕研究

TSG-6對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響

唐悅玲， 李小靜， 陳 釗, 洪學(xué)哲， 馬 莉

目的在重組人腫瘤壞死因子-α刺激基因-6干擾前后,檢測(cè)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax的表達(dá)情況及細(xì)胞凋亡情況，探討腫瘤壞死因子-α刺激基因-6與病理性瘢痕形成的關(guān)系及其機(jī)制。方法增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織各5例，以組織塊貼壁法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)傳代至第3、4代后，以TUNEL法和透射電鏡法檢測(cè)重組人腫瘤壞死因子-α刺激基因-6干擾對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響，以免疫組化法檢測(cè)各組成纖維細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達(dá)的變化。結(jié)果TUNEL和透射電鏡顯示，重組人腫瘤壞死因子-α刺激基因-6促進(jìn)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡。免疫組化顯示，病理性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)減少，而Bax表達(dá)增多。結(jié)論腫瘤壞死因子-α可抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)。

病理性瘢痕； 成纖維細(xì)胞； 腫瘤壞死因子-α刺激基因-6； Bcl-2； Bax

成纖維細(xì)胞增殖異常是病理性瘢痕(主要包括瘢痕疙瘩和增生性瘢痕)過度增生和持續(xù)存在的原因[1-3]，但病理性瘢痕的形成機(jī)制尚不完全清楚。近年來，通過對(duì)病理性瘢痕與炎癥之間關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤壞死因子-α刺激基因-6(tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6， TSG-6)有著密切的關(guān)系。自2012年11月至2013年10月，筆者采用重組人TSG-6對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞干預(yù)后，對(duì)其凋亡的情況進(jìn)行研究，探討TSG-6在病理性瘢痕形成中的可能作用及相關(guān)機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清,高糖DMEM,雙抗,TUNEL試劑盒購(gòu)于美國(guó)TREVIGEN公司；重組人TSG-6 50μg購(gòu)于美國(guó)R&DSYSTEMS公司； 兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗體，SP試劑盒和DAB試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 研究對(duì)象與分組 所有標(biāo)本來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的組織，均取得患者同意并簽署知情同意書。本組患者共10例，其中增生性瘢痕5例，瘢痕疙瘩5例。男性6例，女性4例；年齡2～32歲，平均16.1歲，所有患者未經(jīng)過任何治療且癥狀明顯，病程6個(gè)月至1年。手術(shù)切除后立即以生理鹽水清洗，并修剪去表皮后，用75%乙醇清洗，再以生理鹽水清洗3遍，裝入含有培養(yǎng)液(20%胎牛血清和雙抗)的無菌培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室備用。切取瘢痕組織的同時(shí)切取部分正常的皮膚組織，保留備用。

1.3 成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng) 采用組織塊貼壁法[4-5]培養(yǎng)病理性瘢痕組織的成纖維細(xì)胞，每周更換細(xì)胞培養(yǎng)液2、3次，10～14 d，可見組織塊周圍有細(xì)胞萌出，當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞連接成片(鋪滿培養(yǎng)瓶底80%左右)時(shí)，可行傳代，取第3、4代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 TUNEL檢測(cè) 取第3代病理性性瘢痕成纖維細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化，制成 l×105/ml細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中(每孔接種1 ml)，每組3孔。24 h后，其中一組細(xì)胞加入2 μg[6]的重組人TSG-6，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 免疫組化檢測(cè)Bcl-2、Bax 病理性瘢痕成纖維細(xì)胞處理同TUNEL檢測(cè)。常規(guī)處理經(jīng)過固定、烤片后，采用檸檬酸(0.01 mol/L，pH 6.0)微波法進(jìn)行抗原修復(fù)。免疫組織化學(xué)采用SP法，DAB顯色。將上述抗體染色結(jié)果顯示為陽性的標(biāo)本作為對(duì)照，將PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。

1.6 透射電鏡觀察 取第3代病理性瘢痕成纖維細(xì)胞和正常的成纖維細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成6 ml的 l×105/ml細(xì)胞懸液，分為兩等份分別在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24 h后，病理性瘢痕組加入2 μg的重組人TSG-6，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，PBS漂洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化后，1200 r/min,離心5 min，傾去上層離心液，沿管壁緩慢加入1 ml 1%戊二醛固定液固定，制作切片，透射電鏡觀察成纖維細(xì)胞。

1.7 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)半定量分析 根據(jù)光學(xué)顯微鏡下免疫組化染色法結(jié)果判斷陽性率。閱片時(shí)每例樣本在高倍顯微鏡(×400)下觀察成纖維細(xì)胞， 陽性率為陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值。根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度及其所占比例制定免疫組化半定量記分標(biāo)準(zhǔn)。最后采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，同樣的高倍顯微鏡下，分別取5個(gè)視野，采用Image pro plus 5.0 軟件分析測(cè)量圖像，測(cè)量指標(biāo)為陽性區(qū)域平均光密度A值(IA)，取每例標(biāo)本IA值的平均值表示該標(biāo)本目的蛋白的總表達(dá)強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)和方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組的表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組(圖1)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，2。

2.2 重組人TSG-6對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 ①Bcl-2對(duì)照組的表達(dá)比實(shí)驗(yàn)組高(圖2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②Bax 對(duì)照的表達(dá)比實(shí)驗(yàn)組低(圖3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，2。

圖1 病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中凋亡的表達(dá) a.對(duì)照組 b.實(shí)驗(yàn)組

Fig1 Expression of apoptosis in pathological scar fibroblasts. a. control group. b. experimental group.

表1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中IA

檢測(cè)目標(biāo)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組tP增生性瘢痕Bax0．26±0．050．47±0．037．516<0．001增生性瘢痕Bcl?20．20±0．030．12±0．023．808<0．001增生性瘢痕TUNEL0．11±0．030．21±0．025．147<0．001

表2 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中IA

檢測(cè)目標(biāo)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組tP瘢痕疙瘩Bax0．28±0．070．57±0．048．003<0．05瘢痕疙瘩Bcl?20．19±0．020．14±0．013．358<0．05瘢痕疙瘩TUNEL0．09±0．010．22±0．074．152<0．05

2.3 透射電鏡檢測(cè)成纖維細(xì)胞的變化 電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)可見纖維組織，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞內(nèi)可見凋亡小體及大量的自噬小體，疑似凋亡(圖4，5)。

3 討論

TSG-6是Lee等[7]在篩選腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis facfor-α, TNF-α)干預(yù)人纖維細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)的受TNF-α調(diào)節(jié)、參與多種炎性反應(yīng)的新基因[8-9]。Tan等[10]采用無瘢痕修復(fù)皮膚作為對(duì)照組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中TSG-6表達(dá)較無瘢痕修復(fù)皮膚明顯減少，首次證明TSG-6表達(dá)的減少可能是導(dǎo)致病理性瘢痕形成的一個(gè)重要因素。

洪學(xué)哲等[11]在初期實(shí)驗(yàn)中采用RT-PCR法及常規(guī)HE、免疫組化染色法在核酸及蛋白質(zhì)水平檢測(cè)TSG-6在正常皮膚和病理性瘢痕中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)病理性瘢痕組織中TSG-6基因的mRNA及其蛋白表達(dá)較正常皮膚明顯上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)研究顯示，增生期瘢痕組織成纖維細(xì)胞過度增殖，膠原等細(xì)胞外基質(zhì)大量合成與分泌，其中成纖維細(xì)胞是參與組織修復(fù)的主要功能細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，膠原等細(xì)胞外基質(zhì)主要是由成纖維細(xì)胞合成和分泌的[12-13]。因此，抑制成纖維細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡成為治療病理性瘢痕的關(guān)鍵[14]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自身精確調(diào)控的自發(fā)程序性死亡。正常情況下，細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡保持著一種動(dòng)態(tài)平衡，以維持多細(xì)胞生物自身的穩(wěn)定。若成纖維細(xì)胞為主的增殖活性增強(qiáng)，不能進(jìn)入正常的凋亡途徑，其合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)在組織中大量沉積，難以被組織吸收或重塑，最終導(dǎo)致病理性瘢痕的形成[14]。因此，通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，抑制瘢痕形成，是瘢痕治療的關(guān)鍵。Bcl-2[15]原癌基因家族被認(rèn)為是決定細(xì)胞死亡的一個(gè)重要機(jī)制,Bcl-2家庭成員分為抗細(xì)胞凋亡的Bcl-2和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Bax。本研究顯示，病理性瘢痕的成纖維細(xì)胞在重組人TSG-6的作用下，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，病理性瘢痕的成纖維細(xì)胞內(nèi)凋亡小體及自噬小體增多，但細(xì)胞的形態(tài)未見明顯改變。該結(jié)果表明，TSG-6可能是通過促進(jìn)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的表達(dá)和抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)，以及增加自身自噬，達(dá)到抗瘢痕的作用。Oh等[15]通過家兔角膜外傷瘢痕模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TSG-6能在創(chuàng)傷早期抑制中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制角膜瘢痕的形成。

圖2 Bcl-2在病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá) a.對(duì)照組 b.實(shí)驗(yàn)組圖3 Bax在病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá) a.對(duì)照組 b.實(shí)驗(yàn)組圖4 透射電鏡下病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡圖5 透射電鏡下病理性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬

Fig2 Bcl-2 expression in pathological scar fibroblasts. a. control group. b. experimental group.Fig3 Bax expression in pathological scar fibroblasts. a. control group. b. experimental group.Fig4 Apoptosis of pathological scar fibroblasts under TEM.Fig5 Autophagy of pathological scar fibroblasts under TEM.

本研究表明，TSG-6與病理性瘢痕的形成密切相關(guān)，進(jìn)一步闡明了其在病理性瘢痕形成過程中對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，但其仍為病理性瘢痕的臨床治療提供了一個(gè)新的治療方向，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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EffectofTSG-6onfibroblastapoptosisofpathologicalscar

TANGYue-ling,LIXiao-jing,CHENZhao,etal.
(DepartmentofPlasticSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

ObjectiveTo examine the effect of tumor factor alpha stimulated gene-6 on the Bcl-2, Bax expression and apoptosis in the fibroblasts of pathological scar and explore relationship between the tumor factor alpha stimulated gene-6 and formation of pathological scar and its formational mechanism.MethodsThe samples were harvested from hyperplastic scar and keloid, and then were cultured to fibroblasts with adherence method. The fibroblasts were treated with tumor factor alpha stimulated gene-6 at 3rd and 4th passage, and then the fibroblasts apoptosis were detected by TUNEL and transmission electron microscope methods and the expression of Bcl-2 and Bax was detected by immunohistochemisty in the two groups.ResultsTumor factor alpha stimulated gene-6 significantly promoted cell apoptosis of pathological scar fibroblasts by TUNEL and transmission electron microscope. The expression of Bcl-2 in the fibroblasts of pathological scar decreased, while the expression of Bax increased by IHC.ConclusionThe pathological scar formation is associated closely with tumor factor alpha stimulated gene-6. Tumor factor alpha stimulated gene-6 may inhibit the formation of pathological scar by inhibiting pathological scar fibroblasts′ proliferation and promoting its apoptosis, which may be related with the expression of Bax and Bcl-2.

Pathological scar； Fibroblast； Tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6； Bcl-2； Bax

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.03.010

R619.6

A

1673-7040(2014)03-0157-04

2013-12-25)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272107)；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11040606M202)

230022 安徽 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 整形外科(唐悅玲，李小靜，陳 釗)；第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 燒傷整形外科(洪學(xué)哲)；安徽中醫(yī)藥大學(xué) 美容教研室 (馬 莉)

唐悅玲(1985-)，女，安徽阜陽人，碩士研究生.

李小靜，230022，安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 整形外科，電子信箱： lixiaojing5@163.com