楊玲玲， 劉曉燕

實驗研究

富血小板血漿對人原代脂肪來源干細胞增殖的影響

楊玲玲， 劉曉燕

目的觀察富血小板血漿對人原代脂肪來源干細胞增殖的影響。方法脂肪組織及靜脈血來源于6例吸脂的女性患者，在無菌條件下，從脂肪組織中分離獲取含原代脂肪來源干細胞的血管基質(zhì)成分；在吸取脂肪的同時，抽取等單位體積的靜脈血，離心制備獲得富血小板血漿。采用Cellometer細胞計數(shù)儀及輔助，吖啶橙-碘化丙啶染色法對血管基質(zhì)成分活細胞進行細胞計數(shù)；血液分析儀對富血小板血漿進行細胞計數(shù)。將細胞分為實驗組與對照組，兩組分別用含5%、10%、15%的富血小板血漿及含10%胎牛血清培養(yǎng)液干預。細胞計數(shù)儀檢測在24,48,72,96 h時，原代脂肪來源干細胞的數(shù)量值。結(jié)果①本實驗血管基質(zhì)成分成骨、成脂轉(zhuǎn)化實驗為陽性；Mark檢測，第3代脂肪來源干細胞CD73、CD90為陽性，CD45為陰性，逆推驗證，可從血管基質(zhì)成分中，可獲取原代脂肪來源干細胞；②通過血清離心法可獲得約平均全血4倍的血小板；③實驗組較對照組在24,48,72,96 h時，ADSCs數(shù)量增多，密度增大，其中72，96 h時段中，不同濃度的富血小板血漿對脂肪來源干細胞增殖有明顯的促進作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論富血小板血漿對體外培養(yǎng)的人原代脂肪來源干細胞的增殖有促進作用。

富血小板血漿； 脂肪來源干細胞； 血管基質(zhì)成分

脂肪來源干細胞(adipose-drived stem cells, ADSCs)，主要來源于脂肪組織，已被證實可分化為多種成體細胞(脂肪、軟骨、骨、肌肉、神經(jīng)等)。脂肪組織在腹部、腰部及臀部獲取容易，且損傷小，但體外擴增ADSCs培養(yǎng)至第3代時間較長，給患者帶來不便，同時增加感染的概率。富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)是全血離心后獲得的血小板濃縮物，富含多種生長因子。自2012年2月至2013年9月，筆者以ADSCs作為種子細胞，觀察自體PRP對原代ADSCs增殖的影響，為提高ADSCs快速擴增、分化及自體細胞輔助脂肪移植技術(cell-assisted lipontransfer, CAL)提供實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 主要試劑及來源

低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基(美國HYCLONE公司),胎牛血清、胰蛋白酶 、β-甘油磷酸鈉、維生素C(沈陽博而美公司),Ⅰ型膠原酶 (美國INVITROGEN公司),CD45、CD90、CD73、HLA-DR、IgG1(美國BD公司)，淋巴細胞分離液(天津川貢公司)，注射用胰島素 (美國禮來公司)，吲哚美辛、IBMX、吖啶橙(acridine oran， AO) 染色劑、碘化丙啶(propidium iodide， PI)染色劑(美國SIGMA公司)，地塞米松(北京SCOLARBIE公司)，油紅O、茜素紅(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 儀器設備

負壓脂肪吸引器XYQ-2，專用吸脂針(側(cè)孔為2 mm×3 mm,北京科儀真燕山醫(yī)療技術有限公司)，超凈工作臺 (蘇州安泰空氣技術有限公司)，恒溫孵箱(日本三洋公司)，低溫高速離心機(長沙鑫奧公司)，分析天平(上海精密科學儀器有限公司)，熒光倒置顯微鏡(DFC425C,德國LECIA公司)，Cellometer活細胞計數(shù)儀(美國 NEXOCELCOM公司)，恒溫水浴箱(上海精宏實驗設備有限公司)，移液器(德國EPPENDORF公司)。

1.3 組織來源

所有組織均來源于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院整形外科行腹部吸脂的6例健康女性。年齡25～40歲。脂肪組織取自吸脂患者廢棄的脂肪組織顆粒，平均脂肪抽吸物為150 ml。同時抽取等單位體積的靜脈血，平均10 ml。

2 實驗方法

2.1 ADSCs原代分離提取及計數(shù)

取吸脂術中吸出的脂質(zhì)部分150 ml，用生理鹽水沖洗3次，移至離心管中。加入0.1%等量膠原酶，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育消化45 min，每10 min振蕩1次，充分消化纖維組織和血管壁等物質(zhì)。用等量體積的完全培養(yǎng)基中和后，以1800 r/min離心5 min，離心物分為4層，即油脂層、脂肪層、液體層和細胞沉淀層。取離心后的細胞沉淀層，每管加入5 ml無菌生理鹽水，吹打成細胞懸液。用70目濾網(wǎng)過濾結(jié)締組織至新離心管中，制成5 ml細胞懸液。取新離心管，加入10 ml人用淋巴細胞分離液(與細胞懸液的體積比為2∶1)，將細胞懸液沿管壁緩慢加入到淋巴細胞分離液上層。平衡離心管后，2300 r/min離心10 min。吸出上層的液體棄掉，中間的單核樣細胞加到另一新的離心管中，加入無菌生理鹽水至50 ml，吹打混勻。平衡離心管，1800 r/min離心5 min，洗去淋巴細胞分離液。棄上清后，加入等量DMEM培養(yǎng)基重懸，制成含原代ADSCs的血管基質(zhì)成分(stromal vascular fraction cells, SVF)細胞懸液。搖勻，取0.1 ml細胞液進行Cellometer細胞計數(shù)儀檢測，其余細胞沉淀，進行培養(yǎng)。

2.2 PRP的制備及含量測定

將靜脈血分別置入裝有0.25 ml枸櫞酸鈉抗凝劑的3 ml采血管中，每管各采血2 ml，采集5管。采用二次離心法,1000 r/min離心15 min。離心后，管內(nèi)液體分為上清液層和紅細胞層。吸取上層血漿及其交界面下約2 mm的血小板，制成含血小板的細胞懸液，3000 r/min離心8 min，棄上層血漿，將剩余液體與激活劑(1000 U凝血酶與10%CaCl2的混合物)以9∶1混合，振蕩，4 ℃冰箱過夜。次日，血凝塊充分收縮后，1000 r/min離心10 min，吸取全部上清液，此上清液即為PRP，0.22 μm 濾器過濾除菌，備用。同時進行全血及PRP血小板計數(shù)，PRP血小板含量達到或超過全血的4倍左右，則為達到實驗要求的PRP。用沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科血液分析儀進行離心前及離心后的血小板計數(shù)。

2.3 PRP對原代ADSCs的干擾濃度分組與時段分組的體外增殖培養(yǎng)

將提取的SVF細胞以1×103/孔的密度接種至24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)基，實驗組：5%PRP 10 μl+DMEM 190 μl+ADSCs 50 μl、10%PRP 20 μl+DMEM 180 μl+ADSCs 50 μl、15%PRP 30 μl+DMEM 170 μl+ADSCs 50 μl；對照組： 10%胎牛血清20 μl+DMEM 180 μl+ADSCs 50 μl。每組設5個復孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行孵育，分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h消化，搖勻，取0.1 ml細胞液進行Cellometer細胞計數(shù)儀,輔助AO-PI檢測法進行檢測，計數(shù)后更換培養(yǎng)液。

2.4 Cellometer細胞計數(shù)儀及輔助A0-PI檢測PRP對ADSCs增殖的干擾

在濃度分組與時段分組中，用微量加樣槍取18 μlAO溶液和2 μl PI溶液在Eppendorf管內(nèi)混勻，再加入20 μl 細胞懸液的細胞樣本，將其混勻后取20 μl混合液于1 min內(nèi)加至Cellometer細胞計數(shù)板的加樣室，每個細胞樣本測量3次。計算軟件獲取圖像，并分析細胞數(shù)量。

2.5 ADSCs鑒定

2.5.1 原代ADSCs轉(zhuǎn)化成脂 脂肪誘導DMEM培養(yǎng)基(1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L 胰島素，200 μmol/L 吲哚美辛，0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌呤, 10%胎牛血清)。調(diào)整細胞濃度，以1×105細胞/孔的濃度接種于24孔板中，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2條件下進行培養(yǎng)。每2、3 d換液1次。定向分化誘導14 d后，用油紅O染色定性觀察體外誘導分化的結(jié)果。

2.5.2 原代ADSCs轉(zhuǎn)化成骨 成骨誘導DMEM培養(yǎng)基(10 mmol/L、β-甘油磷酸鈉、10 mmo/L 地塞米松、新鮮制備的0.2 mmol/L維生素C，10%胎牛血清)。調(diào)整細胞濃度，以1×105細胞/孔的濃度接種于24孔板中，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2條件下進行培養(yǎng)。每2、3 d換液1次。定向分化誘導14 d后，用茜素紅定性觀察體外誘導分化的結(jié)果。

2.5.3 第3代ADSCs流式細胞儀鑒定 選取生長狀態(tài)良好的第3代細胞，細胞融合度已達80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化，然后用PBS緩沖液進行洗滌，將獲得細胞懸液以1000 r/min離心3 min。棄上清后，加入完全培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，分成6份分別裝于6個1.5 ml的Eppendorf管中，每管分別加入100 μl的細胞懸液。室溫避光條件下，分別加入抗人單克隆抗體，CD45、CD90、CD73、HLA-DR、IgG1，每種加入20 μl。避光靜置15 min，PBS洗滌以去除未結(jié)合的抗體，以1500 r/min離心5 min，加入PBS重懸，分別將重懸后的細胞移入流式檢測管中，進行流式細胞儀檢測并分析結(jié)果，CELLQUEST軟件處理并分析數(shù)據(jù)，計算各組細胞的陽性表達率。

2.5.4 統(tǒng)計學方法 本實驗為計量數(shù)據(jù)，時間的分組與濃度分組的ADSCs細胞計數(shù)采用均數(shù)方差分析比較，當方差分析結(jié)果P<0.05時，進一步采用LSD法進行組間兩兩比較，使用統(tǒng)計學計算軟件SPSS。

3 結(jié)果

3.1 SVF細胞計數(shù)及ADSCs的鑒定

通過負壓吸脂獲取的脂肪組織，經(jīng)消化、過濾、離心后，得到含ADSCs的SVF細胞。獲取的SVF活細胞的平均數(shù)量為(5.31±2.62)×104/ml。提取的SVF單個核細胞誘導可轉(zhuǎn)化成脂及成骨(圖1～4)，Mark結(jié)果流式細胞檢測顯示，第3代脂肪來源干細胞的CD73、CD90為陽性，CD45為陰性(圖5)。

3.2 血小板計數(shù)

全血血小板離心前計數(shù)為(151.33±59.03)×109/L,PRP血小板離心后計數(shù)為(615.83±229.78)×109/L，PRP的血小板是全血的4.07倍。

圖1 原代ADSCs加入成脂誘導培養(yǎng)基定向分化14 d后胞漿可見反光的脂質(zhì)小滴(×40)圖2 油紅O染色胞漿中見大小不等的紅色脂滴(×40)圖3 原代ADSCs加入成骨誘導培養(yǎng)基定向分化14 d后見鈣化結(jié)節(jié)(×20)圖4 茜素紅染色呈陽性圖5 流式細胞儀分析結(jié)果

Fig1 Lipid accumulates within the cell in small vacuoles, which appear as droplets after 14 days of primary ADSCs adipogenic differentiation.Fig2 Adipoenesis stained with Oil Red O.Fig3 Appear calcify after 14 days of primary ADSCs osteogenesis differentiation.Fig4 Alizarin red staining is positive.Fig5 Analysis of flow cytometry.

3.3 PRP對ADSCs增殖能力的影響

不同時間段的ADSCs細胞計數(shù)比較可見，隨著PRP濃度逐漸增加，ADSCs的細胞數(shù)量逐漸增加。因此，PRP對ADSCs增殖有明顯促進作用，數(shù)量統(tǒng)計學不同時間段的ADSCs細胞計數(shù)的組間比較見表1，生長曲線見圖6。其中，在24 h與48 h的時間段中，不同濃度的PRP對ADSCs增殖的細胞數(shù)量的影響統(tǒng)計學無明顯差異(P>0.05)；72 h與96 h的時間段中，不同濃度的PRP對ADSCs增殖的細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，當方差分析結(jié)果P<0.05時，進一步采用LSD法進行組間兩兩比較(表2)。結(jié)果顯示，在72 h時段中，15%PRP組細胞數(shù)量值高于對照組和5%PRP組(P<0.05)； 96 h時段中，5%PRP與對照組的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余組間內(nèi)的細胞數(shù)量值的比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

3.4 ADSCs形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡可見，原代ADSCs形態(tài)呈球形，明亮強反光，懸浮于培養(yǎng)液中，未貼壁。接種24 h后，細胞貼壁呈短梭形或卵圓形；接種48 h后，貼壁細胞數(shù)量增加，形態(tài)伸展，呈長梭形；接種72 h后，貼壁細胞數(shù)量增加，形態(tài)更加清晰，呈類似成纖維細胞的長梭形外觀；接種96 h后，細胞生長較前有所加快，密度增加，形態(tài)呈長梭形、多角形或不規(guī)則形。于24,48,72,96 h計數(shù)后半量換液，懸浮紅細胞等雜質(zhì)大多被清除，細胞形態(tài)更清晰(圖7)。

4 討論

ADSCs[1-2]來源于脂肪組織，通過分離及培養(yǎng)獲得的一種多向分化潛能的干細胞，其增殖、分化過程受多種細胞因子及激素的調(diào)節(jié)。PRP是來源于自體血液，通過離心全血后得到的血小板的濃縮物[3]。激活后的PRP釋放組織生長所需的大量細胞因子及蛋白質(zhì)等養(yǎng)分，可為ADSCs提供適宜的生長環(huán)境。自體脂肪移植是治療軟組織缺損和填充的金標準，缺點是脂肪移植有不可預見性，如重吸收率達40%～60%，或因壞死形成鈣化和囊腫。有學者發(fā)現(xiàn)，吸收與脂肪移植后血管新生的速度有關，主要是由于營養(yǎng)缺乏和代謝物沉積導致脂肪細胞凋亡[4]。Yoshimura等[5-6]針對臨床脂肪移植出現(xiàn)的脂肪組織吸收率較高、ADSCs細胞數(shù)量減少的情況，提出了CAL方法，即將新抽取脂肪組織等比例的兩部分，一份用膠原酶消化法提取SVF，另一份抽取的脂肪作為生物支架，將含有ADSCs的SVF加入到抽吸的脂肪中進行混合移植，提高ASDCs轉(zhuǎn)化成脂的比例，從而有助于移植脂肪顆粒的存活。近期報道，PRP復合脂肪移植能有效地減少脂肪吸收[7-8]。Cervelli等[9]在每毫升的脂肪組織加入0.5 ml的PRP，輪廓在術后1年仍維持50%～62%。

圖6 不同濃度的PRP和不同時間段對ADSCs增殖的影響圖7 PRP濃度分組與時段分組的ADSCs形態(tài)學觀察

Fig6 Growth curvature of ADSCs count at at different times and condensations of PRP.Fig7 Histological observation of ADSCs at different times and condensations of PRP.

表1 不同時間段的ADSCs細胞計數(shù)的組間比較

時間對照組5%PRP組10%PRP組15%PRP組F值P值24h3．037±0．7293．117±1．0193．650±1．1724．342±0．9442．930．067848h5．347±1．8664．747±0．7575．859±0．5376．145±0．9193．020．062772h6．212±1．1906．252±0．8627．435±1．8689．220±1．1865．490．009596h7．127±1．4157．920±1．4349．948±1．16412．787±1．37826．98<0．0001

表2 不同時間段的ADSCs細胞計數(shù)的組間兩兩比較結(jié)果

Tab2 Result of comparison between the groups of ADSCs cell countingin different time

比較組P值72h對照組vs5%PRP組0．9632對照組vs10%PRP組0．1720對照組vs15%PRP組0．00305%PRP組vs10%PRP組0．18565%PRP組vs15%PRP組0．003410%PRP組vs15%PRP組0．053896h對照組vs5%PRP組0．2665對照組vs10%PRP組0．0009對照組vs15%PRP組<0．00015%PRP組vs10%PRP組0．00995%PRP組vs15%PRP組<0．000110%PRP組vs15%PRP組0．0009

目前制作PRP的方法很多，主要有血漿分離置換法、二次離心法、三次離心法等，但缺乏標準性。Kakudo等[10]制備出7.9倍的PRP。筆者采用二次離心法獲得約全血4倍的血小板，首先離心下層沉淀紅細胞，再次離心分離上層貧血小板血漿，從而純化PRP，激活后應用。有學者報道，每毫升脂肪中提取SVF細胞平均含有1×105～1×106個原代ADSCs[11-12]。本研究中，提取的SVF活細胞數(shù)量為(5.31±2.62)×104/ml。相比之前的研究，細胞產(chǎn)量較低，可能與脂肪獲取方式、實驗操作方法和細胞計數(shù)儀的靈敏性有關。筆者通過給予適當?shù)腟VF培養(yǎng)干預，使細胞轉(zhuǎn)化成脂、成骨；原代ADSCs繼續(xù)培養(yǎng)至第3代，用流式細胞檢測儀分析細胞表型，逆推驗證SVF中含有ADSCs。采用Cellometer細胞計數(shù)儀及輔助AO-PI染色法根據(jù)細胞形態(tài)特征，自動、快速測量細胞數(shù)量及測量活細胞的比率。在以往的研究中，PRP可有效促進第3代ADSCs增殖和分化[13]。Van Pham等[14]報道，PRP可代替胎牛血清，15%PRP增強ADSCs增殖的最優(yōu)濃度。Liu等[15]認為,10%～12.5%富含血小板血漿誘導似乎是最佳的濃度。然而幾乎沒有關于PRP對原代ADSCs增殖影響報道。本研究在原代ADSCs加入PRP后，隨著PRP濃度梯度逐漸增大，ADSCs的細胞數(shù)量逐漸增多，說明PRP能促進原代ADSCs的增殖，15%PRP的促進作用更明顯。不足之處是，由于含原代ADSCs的SVF也包含多種其他細胞等雜質(zhì)，通過兩次離心及淋巴細胞裂解液作用去除血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、周細胞以及大量血液循環(huán)來源的細胞，但仍存在異質(zhì)性。樣本量較小，若增加樣本量，統(tǒng)計結(jié)果將更為準確。

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Effectofplatelet-richplasmaontheproliferationofprimaryadipose-derivedstemcells

YANGLing-ling,LIUXiao-yan.
(DepartmentofPlasticSurgery,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo observe the effects of platelet-rich plasma on the number, growth rate and adipogenic differentiation potential of adipose-derived stem cells.MethodsAdipose tissue and venous blood was collected from 6 liposuction female patients. Adipose tissue was separated under sterile condition to collect the stromal vascular fraction cells that contains adipose-derived stem cells. Platelet-rich plasma was isolated from the unit volume of venous blood of the same liposuction patient by the use of centrifugation. Cellometer analyser and AO-PI staining was used to count the amount of stromal vascular fraction living cells. Hematology analyser was used for cell counting on platelet-rich plasma. In vitro experiment, cells were divided as treatment and control groups. The treatment group contained 5%, 10% and 15% platelet-rich plasma while the control group contained 10% fetal bovine serum as the conditions for culture fluid intervention. Cell counting instruments collected the cell count from the control and treatment groups at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h.Results① In this experiment, the stromal vascular fraction osteoblastic and adipogenic conversion test were positive; Detected with Mark test, the expression of CD73 and CD90 at 3rd generation adipose-derived stem cells was positive while the CD45 was negative. This experiment proved adipose-derived stem cells could be collected from stromal vascular fraction. ② Serum centrifugation could obtain an average 4 times platelet of whole blood. ③ Compared with the control group, platelet-rich plasma in treatmental group had higher adipose-derived stem cells number with a increased density (P<0.05) at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h. The platelet-rich plasma with diferent concentration at 48 h and 96 h had obviously promotive effect on the adipose-derived stem cells which had a statistical significance (P<0.05).ConclusionPlatelet-rich plasma can contribute to the growth of primary adipose-derived stem cells in vitro.

Platelet-rich plasma； Adipose-derived stem cells； Stromal vascular fraction

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.03.019

R622.9

A

1673-7040(2014)03-0180-05

2013-12-08)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(楊玲玲)；沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科(劉曉燕)

楊玲玲(1984-)，女，沈陽人，碩士研究生.

劉曉燕，110016，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科，電子信箱：kk-lxy@sohu.com