程洪杰，馬珂，秦國宏，張道平，張弢，王旻

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單克隆抗體電荷異構(gòu)體分離方法優(yōu)化

程洪杰，馬珂，秦國宏，張道平，張弢，王旻

210009 南京，中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（程洪杰、王旻）；210042 南京，江蘇先聲藥業(yè)有限公司（程洪杰、馬珂、秦國宏、張道平、張弢）

單克隆抗體是復(fù)雜的四聚體糖蛋白，常呈現(xiàn)微觀不均一性，即“異質(zhì)性”，包括電荷、疏水、形態(tài)等相關(guān)的異構(gòu)體[1]。這些異構(gòu)體可能來自于抗體分子復(fù)雜的生物合成途徑，如細(xì)胞系及培養(yǎng)工藝[2]，也可能來自于純化、制劑等制造過程以及貯存過程的任何階段[1]。其中由于抗體分子所帶電荷差異造成的異質(zhì)性稱為電荷異構(gòu)體，一般分為酸性異構(gòu)體和堿性異構(gòu)體，產(chǎn)生原因主要與翻譯后修飾有關(guān)。電荷異構(gòu)體宏觀表現(xiàn)為在等電聚焦電泳圖上出現(xiàn)彌散或多個(gè)條帶；離子交換色譜圖主峰前后出現(xiàn)小峰。由于這些異構(gòu)體可能會(huì)影響抗體的穩(wěn)定性、藥效、免疫原性或藥代動(dòng)力學(xué)，特征性地識(shí)別和分離電荷異構(gòu)體是至關(guān)重要的。基因泰克公司曾對(duì)上市抗體及臨床前抗體藥物關(guān)于電荷變化產(chǎn)生的藥效、藥代等方面的影響做過一個(gè)總結(jié)，結(jié)果表明：①當(dāng)電荷變異超過一個(gè) pH 單位時(shí)，會(huì)影響藥物的組織分布及藥代動(dòng)力學(xué)；②增加正電荷，會(huì)提高藥物的組織停滯，降低血液清除；③降低正電荷，會(huì)減少藥物的組織停滯，提高藥物的全身清除[3]。因而分離電荷異構(gòu)體，得到均一性質(zhì)的抗體是一個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)，尤其在生物類似物開發(fā)過程中應(yīng)盡可能控制異構(gòu)體含量與原研藥保持一致。

在眾多分離手段中，離子交換層析被認(rèn)為是最有前景的方法[4]。有研究表明，依賴 pH 變化的分離方式比依賴離子強(qiáng)度變化的分離方式效果更好[5-6]。近年來不斷有研究者通過 pH 梯度洗脫方式分離電荷異構(gòu)體。Pabst 等[7]通過控制緩沖液中 Tris、雙 Tris 丙烷、組氨酸、乙醇胺的比例，而 Farnan 和 Moreno[8]通過調(diào)節(jié)緩沖液中哌嗪、咪唑和 Tris 的比例，均實(shí)現(xiàn)了 pH 梯度洗脫，成功分離出抗體的電荷異構(gòu)體，但整個(gè)工藝較為復(fù)雜，pH 控制不穩(wěn)定。近些年，置換色譜憑借其出色的分離能力，已成功被應(yīng)用于分離抗體電荷異構(gòu)體、寡糖、多肽、小分子化合物。但商品化的陽離子層析置換劑 Sachem Expell SP1 成本較高，且伴隨著堿性異構(gòu)體的洗脫過程亦有部分置換劑被洗脫[9]，也帶來一定的安全隱患，此外，置換序列的監(jiān)測(cè)是一項(xiàng)耗時(shí)、難度較大的工作，這些均阻礙其應(yīng)用到生產(chǎn)中。

本課題組經(jīng) CHO 細(xì)胞表達(dá)，Protein A 親和層析、SP-FF 陽離子層析已制備純度達(dá) 95% 以上的單克隆抗體 IgG1，但陽離子層析動(dòng)態(tài)載量較小且洗脫樣品酸性異構(gòu)體含量偏高（≈ 20%），不符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（< 18%）。本研究通過層析介質(zhì)篩選得到動(dòng)態(tài)結(jié)合載量高、分辨率好的層析介質(zhì)。依據(jù)酸性異構(gòu)體 pI（7.23）小于目的組分 pI（7.34），參考 pH 梯度洗脫的原理，在原工藝上增加一步預(yù)洗步驟，特異性去除酸性異構(gòu)體，從而降低最終樣品的酸性異構(gòu)體含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 單克隆抗體溶液 CHO 細(xì)胞發(fā)酵液經(jīng) Protein A 純化，低 pH 值孵育，并用 Tris 中和至 pH 5.8，濃度約 9.13 mg/ml。經(jīng)毛細(xì)管等電聚焦電泳測(cè)定，酸性異構(gòu)體 pI = 7.23，目的組分 pI = 7.34，堿性異構(gòu)體 pI = 7.47。

1.1.2 層析柱 Poros XS 購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；Nuvia S購自美國Bio-Rad 公司；HiTrap SP-FF購自美國GE health 公司；Eshmuno S、Fractogel-EMD SO3-(M)、Fractogel-SE Hicap(M) 均購自德國Merck 公司；HPLC-SEC 為美國Sepax-technologies 公司產(chǎn)品，保護(hù)柱為Zenix SEC-300，50 mm × 7.8 mm，粒徑3 μm；分析柱為300 mm × 7.8 mm ，粒徑3 μm；HPLC-IEC 為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品，分析柱為Propac WCX-10，250 mm × 4 mm。

1.1.3 試劑 Tris 購自美國Amresco 公司；NaH2PO4·H2O、Na2HPO4·12H2O、NaCl、HCl 等為國產(chǎn)分析純?cè)噭?；純水由美國Barnstead 公司超純水儀制備。

1.1.4 儀器 ?KTA purifier 蛋白純化儀為美國GE Healthcare 公司生產(chǎn)，檢測(cè)波長為280 nm；pH 計(jì)為瑞士MettlerToledo 公司產(chǎn)品；Agilent1260 型高效液相色譜儀為美國Agilent 公司產(chǎn)品；Genesys 10UV 紫外可見分光光度儀為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速離心機(jī)為德國Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 介質(zhì)動(dòng)態(tài)載量測(cè)定 以20 mmol/L PB（pH 5.8）為上樣緩沖液平衡層析柱，取Protein A 親和后樣品，20 mmol/L PB（pH 5.8）稀釋至2 mg/ml，先流經(jīng)旁路使紫外吸收值達(dá)到平臺(tái)期后，樣品進(jìn)入層析柱，以穿透樣品紫外吸收值達(dá)到平臺(tái)期的10% 計(jì)算動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（DBC）。流速與各層析柱體積匹配，使保留時(shí)間為1 min。

DBC（mg/ml）=（VA× CO）/VC

VA表示穿透樣品紫外吸收值為平臺(tái)期的10% 的上樣體積；CO表示樣品蛋白濃度；VC表示總的柱床體積。

1.2.2 各介質(zhì)分辨率的考察 取親和樣品用20 mmol/LPB 緩沖液（pH 5.8）稀釋至7 mg/ml，以20 mmol/L PBpH 5.8為上樣緩沖液，基于方法1.2.1的結(jié)果選擇SP-FF、Poros XS、Nuvia S 三種層析介質(zhì)，上樣量為各介質(zhì)動(dòng)態(tài)載量的80%，保留時(shí)間1 min。20 mmol/L PB 平衡，0~ 30% 20 mmol/L PB（pH 5.8）、1 mol/L NaCl 線性洗脫20柱體積，保留時(shí)間3 min。洗脫峰分階段收集，UV 100 ~ 1000 mAU 標(biāo)記為“ELU-1”；1000 mAU ~ 最高值標(biāo)記為“ELU-2”；UV 最高值下降至1000 mAU 標(biāo)記為“ELU-3”；1000 mAU降至100 mAU 標(biāo)記為“ELU-4”。各樣品均進(jìn)行HPLC- IEC/SEC 檢測(cè)。

1.2.3 pH 對(duì)抗體質(zhì)量的影響 取親和樣品，20 mmol/L PB（pH 5.8）稀釋至7 mg/ml，以20 mmol/L PB（pH 5.8）為上樣緩沖液平衡柱子，上樣量為80% DBC，線性流速200 cm/h。以pH 分別為 6.2、6.5、6.8、7.2 的20 mmol/L PB 平衡后，0 ~ 30% 20 mmol/L PB、1 mol/L NaCl 線性洗脫20柱體積。洗脫峰分階段收集，進(jìn)行HPLC-IEC/SEC檢測(cè)。

1.2.4 NaCl 濃度預(yù)洗去除酸性異構(gòu)體的影響 取親和樣品，將pH 9.0 的1 mol/L Tris 調(diào)pH 至6.5，20 mmol/LPB（pH 6.5）稀釋至7 mg/ml，以20 mmol/L PB（pH 6.5）為上樣緩沖液，分別用1.5%、2%、2.5% 的 20 mmol/L PB（pH 6.8）、1 mol/L NaCl 進(jìn)行預(yù)洗，紫外上升至 50 mAU 后收集預(yù)洗峰，0 ~ 30% 20 mmol/L PB（pH 6.5）、1 mol/L NaCl 線性洗脫20 柱體積，洗脫峰分階段收集，進(jìn)行HPLC-IEC/SEC 檢測(cè)。

1.2.5 不同電導(dǎo)率 PB（pH 6.8）緩沖液預(yù)洗固定體積去除酸性異構(gòu)體的影響 20 mmol/L PB（pH 6.8）與200 mmol/L PB（pH 6.8）混合分別配制預(yù)洗緩沖液2.5、3.0、3.5 mS/cm PB（pH 6.8），同時(shí)配制2% 20 mmol/L PB（pH 6.8）、1 mol/L NaCl。取親和樣品，1 mol/L Tris 9.0 調(diào)pH 至6.5，20 mmol/L PB（pH 6.5）稀釋至7 mg/ml，以20 mmol/L PB（pH 6.5）為上樣緩沖液，分別用上述預(yù)洗緩沖液預(yù)洗15 柱體積，紫外上升至 50 mAU 后收集預(yù)洗組分。20 mmol/L PB（pH 6.5），200 mmol/L NaCl 直接洗脫，收集洗脫峰。各樣品進(jìn)行HPLC-SEC/IEC 檢測(cè)。

1.2.6 HPLC-SEC 檢測(cè)蛋白多聚體與碎片含量[10]樣品經(jīng)超濾換液至20 mmol/L PB（pH 5.8）中，用純化水稀釋至2 mg/ml。150 mmol/L PB（pH 7.0）平衡色譜柱，流速1 ml/min。待基線平穩(wěn)，進(jìn)樣10 μl，紫外檢測(cè)波長214 nm，記錄20 min。

1.2.7 HPLC-IEC 檢測(cè)蛋白電荷分布[10]樣品經(jīng)超濾換液至20 mmol/L PB（pH 5.8）中，用純化水稀釋至4 mg/ml。流動(dòng)相A 為20 mmol/L PB（pH 6.2），流動(dòng)相B 為20 mmol/L PB（pH 6.2）、0.3 mol/L NaCl。流動(dòng)相B 清洗色譜柱30 min。92% 流動(dòng)相A、8% 流動(dòng)相B 平衡色譜柱至基線平穩(wěn)，流速0.8 ml/min，柱溫為25 ℃。進(jìn)樣10 μl，紫外檢測(cè)波長為214 nm，記錄35 min。線性梯度洗脫：8% ~ 35% B，0~ 29 min；30 min 之后維持 50% B。

1.2.8 紫外吸收測(cè)定蛋白濃度 將待測(cè)樣品用純水稀釋合適倍數(shù)，使在280 nm 處吸收值處于 0.20.8 范圍內(nèi)。

蛋白濃度（mg/ml）=（280nm× 稀釋倍數(shù)）/消光系數(shù)

2 結(jié)果

2.1 介質(zhì)動(dòng)態(tài)載量測(cè)定

如表1 所示，Poros XS 與Nuvia S 均顯示出較高的動(dòng)態(tài)載量，均在50 mg/ml 以上，而其他幾種介質(zhì)載量比較小，故選擇Poros XS 和Nuvia S 做為候選介質(zhì)。

表 1 介質(zhì)動(dòng)態(tài)載量測(cè)定

2.2 各介質(zhì)分辨率的考察

以原工藝中的SP-FF 作為對(duì)照，通過洗脫峰的分段收集，考察各介質(zhì)分離電荷異構(gòu)體的差異。三種介質(zhì)均只有一個(gè)洗脫峰，各電荷異構(gòu)體洗脫順序與理論一致[11]，酸性異構(gòu)體由于帶電荷少最先被洗脫下來，而堿性異構(gòu)體在目的組分之后被洗脫（圖 1~3），對(duì)照品HPLC-IEC 分析圖譜見圖1。相比于其他兩種介質(zhì)，Poros XS 的酸性異構(gòu)體含量前后差異顯著（圖3），酸性異構(gòu)體主要集中在出峰階段，洗脫峰最后組分ELU-4 約有2.11 柱體積，約占整個(gè)洗脫峰的29.68%，酸性異構(gòu)體已下降至8.64%，此外其相比于其他介質(zhì)粒徑更小，只有50 μm。Nuvia S 洗脫樣品電荷分布也呈現(xiàn)類似情況（圖4），但是其在洗脫峰結(jié)束階段，體積約3.01 柱體積，占整個(gè)洗脫峰的36.13%，酸性異構(gòu)體較多，仍保持18.82%。根據(jù)以上結(jié)果，Poros XS 展現(xiàn)出更好的分離效果，對(duì)于此單抗而言，分辨率更高，故以此介質(zhì)開展后續(xù)探索。

A（mAU） 時(shí)間（min）

A（mAU）酸性異構(gòu)體比例（%） 柱體積

A（mAU）酸性異構(gòu)體比例（%） 柱體積

A（mAU）酸性異構(gòu)體比例（%） 柱體積

2.3 pH 對(duì)抗體質(zhì)量的影響

目前已知，洗脫液成分的小幅度變化以及 pH 值的波動(dòng)均能影響保留時(shí)間、分辨率、洗脫峰的組成。研究表明在陽離子層析中伴隨著鹽離子濃度變化，pH 值也發(fā)生著復(fù)雜變化。因而利用鹽離子梯度洗脫模式，樣品的保留時(shí)間和分辨率不僅取決于可控的鹽濃度，也受不可預(yù)知的 pH 值影響[12]。

通過不同 pH 下鹽離子梯度洗脫，未能將酸性異構(gòu)體單獨(dú)分離出來。圖 5 中數(shù)據(jù)表明洗脫溶液 pH 值越高，越接近于抗體目的組分等電點(diǎn)（pI = 7.34），酸性異構(gòu)體與介質(zhì)的結(jié)合力越弱，出峰階段收集的組分（ELU-1）酸性異構(gòu)體含量越多。其中用 pH 6.8 洗脫時(shí)，ELU-1 中酸性異構(gòu)體含量遠(yuǎn)高于其余兩個(gè) pH。而 pH 值為 7.2 時(shí)，由于太過接近 pI，樣品直接穿透。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，碎片主要是 Fab 片段或 desFab 片段，帶電荷量少，顯示出酸性異構(gòu)體性質(zhì)。多聚體帶電荷量多，與陽離子介質(zhì)電荷作用更強(qiáng)，常顯示堿性異構(gòu)體性質(zhì)[9, 13]。圖 5 中數(shù)據(jù)與理論一致，碎片在出峰階段含量最多，多聚體主要集中在洗脫峰末尾。此外，pH 6.5 和 6.8 條件下，洗脫樣品的多聚體和碎片總體含量明顯低于 pH 6.2。當(dāng) pH ≤ 6.5，樣品偏離等電點(diǎn)較大，較不穩(wěn)定，易發(fā)生分解形成碎片，因而今后可將樣品保存在 pH 6.5 平衡液中進(jìn)行操作。同時(shí)，在洗脫前增加用 pH 6.8 緩沖液預(yù)洗步驟去除酸性異構(gòu)體。洗脫用 pH 6.5 緩沖液，保證洗脫樣品酸性異構(gòu)體總含量較低。

2.4 不同 NaCl 濃度預(yù)洗對(duì)去除酸性異構(gòu)體的影響

由上述實(shí)驗(yàn)可知紫外出峰時(shí)電導(dǎo)率約 4.3 mS/cm，換算成 20 mmol/L PB（pH 6.8）、1 mol/L NaCl 比例為 2%。從圖 6 可看到，用 2%、2.5% 20 mmol/L PB（pH 6.8）、1 mol/L NaCl 預(yù)洗去除的主要是酸性異構(gòu)體，占 60% 以上。洗脫階段收集的組分相比樣品，酸性異構(gòu)體百分含量明顯下降。表明提高緩沖液 pH 并適當(dāng)添加 NaCl 進(jìn)行預(yù)洗確實(shí)能有效去除酸性異構(gòu)體。但是預(yù)洗過程中，紫外上升至某一值后維持平臺(tái)期，無法下降，并未形成明顯的酸性異構(gòu)體峰。且隨著 NaCl 比例上升，預(yù)洗樣品中目的組分比例也逐漸上升，影響了回收率。在該條件下，酸性異構(gòu)體與目的組分電荷性質(zhì)接近，預(yù)洗過程中與介質(zhì)結(jié)合、解離呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，相互影響，并不能使得酸性異構(gòu)體與目的組分完全分離。但可以用預(yù)洗一定柱體積的方式去除部分酸性異構(gòu)體。

A（mAU）酸性異構(gòu)體比例（%） 柱體積

圖 7 不同電導(dǎo)率的 PB（pH 6.8）預(yù)洗 15 柱體積后各洗脫峰電荷分布百分比

2.5 不同電導(dǎo)率 PB（pH 6.8）緩沖液預(yù)洗對(duì)去除酸性異構(gòu)體的影響

不同的離子影響蛋白與介質(zhì)結(jié)合能力，磷酸根比氯離子鹽析作用更強(qiáng)。同時(shí)引入其他類型的鹽離子，容易使pH 值發(fā)生變化[12]。通過探究不外加NaCl，利用不同濃度的PB 緩沖液預(yù)洗，也能有效去除酸性異構(gòu)體。圖7 數(shù)據(jù)表明預(yù)洗過程PB 緩沖液電導(dǎo)率越高，洗脫樣品中酸性異構(gòu)體百分含量越低，但回收率亦逐漸降低，這與之前的探索結(jié)果一致。4 個(gè)洗脫樣品，純度均在99% 以上。2.5 mS/cm或3.0 mS/cm 預(yù)洗后收集到的洗脫樣品（2.5-ELU 表示2.5 mS/cm PB 預(yù)洗后洗脫的樣品，3.0-ELU 表示3.0 mS/cm PB 預(yù)洗后洗脫的樣品）與原樣品對(duì)比，酸性異構(gòu)體含量有明顯下降，由原先約20% 下降至15% 左右，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（< 18%），回收率在80% 左右。而利用3.5 mS/cm以及2% NaCl 預(yù)洗后收集到的洗脫組分[3.5-ELU 表示3.5 mS/cm PB 預(yù)洗后洗脫的樣品，2% NaCl-ELU 表示2% 20 mmol/L PB（pH 6.8）、1 mol/L NaCl 預(yù)洗后洗脫的樣品]酸性異構(gòu)體比例下降十分顯著，已降至2% 以下，從側(cè)面反映了該條件下預(yù)洗去除酸性異構(gòu)體效果非常好。但是回收率較低，低于50%。對(duì)比外加NaCl 和調(diào)節(jié)預(yù)洗緩沖液濃度以獲得合適電導(dǎo)率兩種方式進(jìn)行預(yù)洗，即3.5-ELU 與2% NaCl，結(jié)果顯示無明顯區(qū)別，考慮到大規(guī)模生產(chǎn)的實(shí)用性與簡便性，采用調(diào)節(jié)預(yù)洗緩沖液濃度達(dá)到相應(yīng)電導(dǎo)率的方法更可取。同時(shí)通過線性梯度換算而來的200 mmol/ml NaCl也足以將目的蛋白洗脫下來。

3 討論

隨著質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念逐步在生物制藥產(chǎn)業(yè)的深入，分離、鑒定異構(gòu)體性質(zhì)成為生物藥物生產(chǎn)過程設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮的因素。關(guān)鍵參數(shù)（CQA）的確立也有賴于這些異構(gòu)體對(duì)于藥物安全性、藥效等方面的信息[14]。前期的研究表明，酸性異構(gòu)體含量過多會(huì)降低單抗的藥效學(xué)活性，因而控制酸性異構(gòu)體含量，使之保持在 18% 以下，成為整個(gè)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵參數(shù)之一。

單克隆抗體純化過程，最為經(jīng)典也是最常采用的為親和層析-陽離子/陰離子層析-陰離子/陽離子層析。其中陽離子交換層析為吸附模式，一般用于去除 HCP、多聚體等雜質(zhì)，近年來，控制電荷異構(gòu)體含量愈發(fā)重要，研究者也開始利用陽離子層析分離電荷異構(gòu)體。但是電荷異構(gòu)體由于理化性質(zhì)與目的組分接近，其中酸性異構(gòu)體一般是目的組分經(jīng)唾液酸化、二硫鍵還原、非還原共價(jià)結(jié)合、糖基化、脫酰胺化等過程后產(chǎn)生的復(fù)合形態(tài)[9]，單純通過常用鹽濃度調(diào)節(jié)洗脫液難以達(dá)到理想的分離效果。

本文借鑒了 pH 梯度洗脫的原理，根據(jù)酸性異構(gòu)體pI 小于目的組分 pI，酸性異構(gòu)體與陽離子介質(zhì)結(jié)合相對(duì)較弱的特點(diǎn)，在已結(jié)合狀態(tài)下提高緩沖液 pH 和電導(dǎo)率將大部分酸性異構(gòu)體先洗脫下來，建立一條新的陽離子層析純化工藝?？疾炝?pH、鹽濃度、平衡液電導(dǎo)率對(duì)于酸性異構(gòu)體去除效果的影響，并進(jìn)行條件優(yōu)化，兼顧碎片與多聚含量，最終確定以 20 mmol/L PB（pH 6.5）為上樣緩沖液，用 25 mmol/L PB（pH 6.8）（3.0 mS/cm）預(yù)洗 15 個(gè)柱體積，用 20 mmol/L PB（pH 6.5），200 mmol/L NaCl 洗脫的方案，最終回收率可達(dá)80%以上，純度 99% 以上，酸性異構(gòu)體含量降低至 15%，低于 18%，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。此方法相比于文獻(xiàn)中用的 pH 梯度洗脫、等電聚焦層析、置換色譜，未引入其他緩沖液成分，更為簡單實(shí)用，適合產(chǎn)業(yè)化。純化過程對(duì)一些參數(shù)進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，從而控制酸堿性異構(gòu)體的比例，對(duì)于生物類似物的開發(fā)有重要的參考意義。

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王旻，Email：minwang@cpu.edu.cn; 張弢，Email：zhangtao@ simcere.com

2014-03-05

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.014