張?jiān)S萌，王林林，任浩，何琪楊，陳汝賢，解云英

?

以胰島新生相關(guān)蛋白啟動(dòng)子為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型的建立與初步應(yīng)用

張?jiān)S萌，王林林，任浩，何琪楊，陳汝賢，解云英

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物化學(xué)室

建立以胰島新生相關(guān)蛋白啟動(dòng)子為靶點(diǎn)的高通量篩選模型，用于胰島新生相關(guān)蛋白基因表達(dá)上調(diào)劑的篩選。

以敘利亞金黃地鼠基因組 DNA 為模板擴(kuò)增胰島新生相關(guān)蛋白核心啟動(dòng)子序列，克隆至pGL4.17 質(zhì)粒載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK 共轉(zhuǎn)染金黃地鼠胰島 β 細(xì)胞 HIT-T15，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)活性。對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，以豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)模型的有效性，并利用該細(xì)胞模型對(duì)本研究所的化合物庫(kù)進(jìn)行篩選。

構(gòu)建了重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒 pGL4.17-INGAP，并成功轉(zhuǎn)染 HIT-T15 細(xì)胞株。對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化后，應(yīng)用陽(yáng)性對(duì)照對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，Z' 因子為 0.57，適用于進(jìn)行高通量篩選。用該模型篩選了本所化合物庫(kù)，其中白藜蘆醇顯示出較好的上調(diào)作用，EC50為 1.6 μg/ml。

成功建立了以胰島新生相關(guān)蛋白啟動(dòng)子為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型。

轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子； 藥物評(píng)價(jià)，臨床前； 胰島新生相關(guān)蛋白

糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，并伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，降低了患者的生活質(zhì)量[1]，胰島 β 細(xì)胞過(guò)度凋亡、功能減退是糖尿病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺發(fā)生發(fā)育過(guò)程中，將健康胰腺部分切除或胰管結(jié)扎后，某些誘發(fā)因子能夠刺激胰腺導(dǎo)管前體細(xì)胞分化成胰島 β 細(xì)胞，胰島功能可以通過(guò) β 細(xì)胞再生得以部分恢復(fù)，這一過(guò)程即胰島新生[3-4]。

基礎(chǔ)研究已發(fā)現(xiàn)了一些誘發(fā)胰島新生的先導(dǎo)物，其中胰島新生相關(guān)蛋白（islet neogenesis associated protein，INGAP）是在尋找具有胰島新生活性的內(nèi)源性分子過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)治療性候選物[5]，在胰島新生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，INGAP 能夠促進(jìn) β 細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)I型糖尿病大鼠的高血糖癥狀[5-6]；另外，相關(guān)II期臨床研究證明，INGAP 能夠促進(jìn)內(nèi)源性胰島素分泌，改善血糖控制[7]。因此，INGAP 是一個(gè)潛在的安全有效的糖尿病治療新靶點(diǎn)。

本研究以 INGAP 基因啟動(dòng)子為靶點(diǎn)，建立以細(xì)胞為基礎(chǔ)的、能夠檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄活性的篩選模型，以期發(fā)現(xiàn)能夠特異性上調(diào) INGAP 表達(dá)的活性化合物，為糖尿病的治療提供新的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒 金黃地鼠胰島 β 細(xì)胞株 HIT-T15（ATCC CRL-1777）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；pGM-T 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pGL4.17（luc2/Neo）和 pRL-TK 由本所生物工程室惠贈(zèng)。

1.1.2 工具酶和主要試劑 Ex Taq 酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基為美國(guó) Thermo 產(chǎn)品；胎牛血清為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；血液/細(xì)胞/組織基因組 DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒等購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Dual-Glo 雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（E2920）為美國(guó) Promega 公司產(chǎn)品；豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（PMA）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。

1.1.3 儀器 TC-312 型基因擴(kuò)增儀購(gòu)自英國(guó) Techne 公司；ChemiImager5500 化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自美國(guó) Biorad 公司；Q5000 微量紫外分光光度計(jì)為美國(guó) Quawell Technology Inc 公司產(chǎn)品；EnVision 多功能微孔板檢測(cè)儀為美國(guó) Perkin Elmer 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA 目的片段的體外擴(kuò)增 從敘利亞金黃地鼠肝組織抽提基因組DNA，并以此為模板，根據(jù) GenBank 收錄的 INGAP 基因全序列（AY184211.1）和啟動(dòng)子調(diào)控元件所在位置[8]設(shè)計(jì)引物，上游引物5'CTGTAACCAGATGA TACGATGC 3'（下劃線表示 XhoI酶切位點(diǎn)），下游引物5' AGTTTCAGAGTGCTGCCTTG 3'，擴(kuò)增位于 2177 ~ 3256 bp 區(qū)域的 INGAP 基因啟動(dòng)子序列 1080 bp。PCR 體系反應(yīng)條件為 94 ℃變性4 min；94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 70 s（30 個(gè)循環(huán)）；72 ℃延伸 10 min。

將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，與 pGM-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，藍(lán)白斑法挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。擴(kuò)增質(zhì)粒，提取并測(cè)序鑒定，選取與 GenBank AY184211.1 序列同源性 100% 的克隆，命名為 pGM-INGAP。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 限制性內(nèi)切酶I與II酶切pGM-INGAP 和 pGL4.17，將目的片段與線性 pGL4.17 連接，即把 INGAP 基因啟動(dòng)子序列定向插入到 pGL4.17 載體的熒光素酶報(bào)告基因上游，命名為 pGL4.17-INGAP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并鑒定。

1.2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件的建立與優(yōu)化 HIT-T15 細(xì)胞在含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔 2 ~ 3 天用 0.25% 胰酶消化傳代。在96 孔板中接種細(xì)胞，隔天待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合度達(dá)到 90% 時(shí)，按照 Lipofectamine 2000 說(shuō)明書將 pGL4.17-INGAP 和內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h 后用全培養(yǎng)基換掉轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng) 12 ~ 48 h 檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)活性，并對(duì)影響轉(zhuǎn)染效率的因素如質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 雙熒光素酶活性測(cè)定 采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，以組成性活性的pRL-TK 作為內(nèi)對(duì)照，使重組質(zhì)粒的測(cè)量結(jié)果正態(tài)化。具體方法是：將檢測(cè)試劑置于室溫平衡后，按照說(shuō)明書混合配制，待測(cè)板中棄去上清，用 PBS 洗 3 次后每孔加20 μl 細(xì)胞裂解液（PLB）裂解細(xì)胞 20 min，加入螢火蟲熒光素酶 50 μl，通過(guò) Envision 微孔板多功能檢測(cè)儀讀取熒光素酶活性數(shù)值。然后每孔加海腎熒光素酶混合液 50 μl，立即檢測(cè)，讀數(shù)。

1.2.5 陽(yáng)性對(duì)照的建立、模型評(píng)價(jià)及藥物篩選 為評(píng)價(jià)所構(gòu)建模型的有效性，在轉(zhuǎn)染 6 h 后，將已知的陽(yáng)性化合物 PMA 作用于細(xì)胞模型，12 ~ 48 h 后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)活性，以此來(lái)考察 PMA 在該模型上的作用。

采用 Z'因子法評(píng)價(jià)該模型對(duì)高通量篩選的可用性，根據(jù)公式Z' = 1 – 3（σc++ σc-）/（μc+– μc-）計(jì)算 Z'因子值，其中 μc-和 σc-分別為陰性對(duì)照的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，μc+和 σc+分別為陽(yáng)性對(duì)照的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。Z' ≥ 0.5 認(rèn)為適用于高通量篩選。按照建立的方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的 100 余個(gè)天然產(chǎn)物進(jìn)行初步篩選，篩選濃度為 10 μg/ml，并對(duì)陽(yáng)性化合物進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DNA 目的片段的體外擴(kuò)增

以敘利亞金黃地鼠基因組 DNA 為模板擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了預(yù)期大小的目的片段（圖 1A），將其克隆至 pGM-T 載體，擴(kuò)增并提取純化質(zhì)粒后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與 GenBank（AY184211.1）中收錄的序列有 100% 同源性。

2.2 pGL4.17-INGAP 報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)構(gòu)建的 pGL4.17-INGAP 進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果表明，INGAP 基因上游調(diào)控序列定向插入到 pGL4.17 載體的熒光素酶報(bào)告基因上游（圖1B），成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pGL4.17-INGAP。

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件的建立與優(yōu)化

以轉(zhuǎn)染 pGL4.17-basic 質(zhì)粒的 HIT-T15 細(xì)胞作為陰性對(duì)照，檢測(cè)轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 pGL4.17-INGAP 的細(xì)胞熒光素酶活性，結(jié)果表明，后者的熒光素酶表達(dá)活性明顯增高，說(shuō)明該啟動(dòng)子片段能夠促進(jìn)熒光素酶的表達(dá)。同時(shí)對(duì)質(zhì)粒濃度和重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒比例進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)DNA:Lipofectamine 2000 比例為 1:3（w:V）、pGL4.17-INGAP:pRL-TK 比例為 100:1 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高（圖2，n = 3）。

A：M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：INGAP 啟動(dòng)子序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 B：M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pGL4.17-INGAP 經(jīng)Xho I和Bgl II雙酶切電泳結(jié)果

Figure 1 PCR product of INGAP promoter (A) and restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pGL4.17-INGAP (B)

2.4 陽(yáng)性對(duì)照的建立及模型評(píng)價(jià)

2.4.1 溶劑對(duì)熒光素酶活性的影響 在化合物篩選過(guò)程中，樣品一般溶解在 DMSO 中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng) DMSO 濃度小于 0.1% 時(shí)，基本不會(huì)對(duì)本模型產(chǎn)生明顯影響（圖 3A），因此，DMSO 的終濃度不能高于0.1%。

2.4.2 陽(yáng)性化合物濃度對(duì)熒光素酶活性的影響 由于目前沒(méi)有能夠特異上調(diào)INGAP 的陽(yáng)性藥物的報(bào)道，根據(jù)文獻(xiàn)選擇化合物 PMA 作為陽(yáng)性對(duì)照[8]，并對(duì)PMA 在該篩選模型上的最佳作用濃度進(jìn)行探索。結(jié)果表明，當(dāng) PMA 濃度小于100 ng/ml 時(shí)，相對(duì)熒光素酶活性值隨著 PMA 濃度的增加而升高，呈現(xiàn)濃度依賴性（圖 3B），與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，說(shuō)明 PMA 能有效作用于該模型，提示 PMA 對(duì) INGAP 基因表達(dá)的上調(diào)作用可以通過(guò)熒光素酶的表達(dá)活性反映出來(lái)。

2.4.3 化合物作用時(shí)間對(duì)熒光素酶活性的影響 轉(zhuǎn)染后 6 h 加入 PMA，分別在加藥后 20、24、30、42、72 h 檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)活性。結(jié)果顯示，加藥后 30 h，熒光素酶表達(dá)活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)而升高，超過(guò) 30 h 后隨著時(shí)間延長(zhǎng)活性降低，因此選擇最佳作用時(shí)間為 30 h（圖 3C）。

2.4.4 模型評(píng)價(jià) 以 PMA 為陽(yáng)性對(duì)照，以 Z'因子為指標(biāo)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，本研究建立的模型 Z'因子為 0.57，優(yōu)于進(jìn)行高通量篩選試驗(yàn)所要求的大于 0.5 的標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明本研究建立的以 INGAP 啟動(dòng)子為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型穩(wěn)定可靠，適用于進(jìn)行高通量篩選。

2.5 化合物初步篩選結(jié)果

應(yīng)用該模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選，上調(diào)率 150% 視為陽(yáng)性，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì) INGAP 啟動(dòng)子上調(diào)作用明顯。用不同濃度的白藜蘆醇作用于 pGL4.17-INGAP-HIT 細(xì)胞，結(jié)果顯示，白藜蘆醇對(duì)啟動(dòng)子的上調(diào)作用呈現(xiàn)濃度依賴性，半數(shù)有效濃度為 1.6 μg/ml（圖 4A）。MTT 比色法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì) HIT-T15 細(xì)胞增殖活力的影響，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞毒性較小，IC50= 34.27 μg/ml（圖 4B）。

A：轉(zhuǎn)染試劑濃度對(duì)熒光素酶活性的影響（***P < 0.001 vs 對(duì)照組）；B：重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒比例對(duì)熒光素酶活性的影響（**P < 0.05 vs 對(duì)照組；***P < 0.001 vs 對(duì)照組）

Figure 2 Establishment and optimization of the transient transfection model

A：DMSO 濃度對(duì)熒光素酶活性的影響（***P < 0.001 vs 對(duì)照組）；B：PMA 濃度對(duì)熒光素酶活性的影響（***P < 0.001 vs 對(duì)照組）；C：化合物作用時(shí)間對(duì)熒光素酶活性的影響

Figure 3 The establishment and optimization of the positive control

A：白藜蘆醇對(duì)pGL4.17-INGAP-HIT 細(xì)胞熒光素酶活性的影響；B：白藜蘆醇的細(xì)胞毒性檢測(cè)

Figure 4 Related bioactive research of resveratrol

3 討論

INGAP 是一個(gè)由 175 個(gè)氨基酸組成的、分子量為 16.8 kD 的分泌蛋白，屬于C 型凝集素超家族中的 Reg-III家族，主要在胰腺和小腸表達(dá)，在肝臟中也有少量表達(dá)[6]。INGAP 啟動(dòng)子序列長(zhǎng)約3 kb，包括了 TATA-box、CAAT box、AP-1 等通用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，還包括胰腺特有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這些轉(zhuǎn)錄因子包括 PDX-1、PAN-1、Isl-1、Ngn3、NeuroD 等，在胰腺細(xì)胞分化過(guò)程中起到重要的指向作用，直接影響 INGAP 啟動(dòng)子的活性[8-9]。我們選擇 HIT-T15 細(xì)胞作為載體，該細(xì)胞雖然高度分化，但仍保留了正常胰島細(xì)胞的很多功能，能夠內(nèi)源性表達(dá) PDX-1、NeuroD 和 PAN-1等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[10]，提供了比較真實(shí)的 INGAP 在胰腺中表達(dá)的天然環(huán)境。另外，本研究選取的 INGAP 基因啟動(dòng)子序列，包括了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和若干重要的順式作用調(diào)控元件等核心啟動(dòng)子區(qū)域，能夠較好地反映活性物質(zhì)在體內(nèi)的綜合作用效果。

構(gòu)建的模型采用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)作為檢測(cè)手段，以海腎熒光素酶質(zhì)粒作為內(nèi)參，通過(guò)內(nèi)參的校正能夠把影響細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)確性的內(nèi)在因素的變化降到最小，并且利用該模型進(jìn)行篩選時(shí)，只需關(guān)注相對(duì)熒光素酶活性的變化，方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、靈敏性高[11]。

利用該研究建立的模型對(duì)本研究所化合物庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)INGAP 啟動(dòng)子有明顯上調(diào)作用，EC50= 1.6 μg/ml，具有深入研究的價(jià)值。白藜蘆醇是天然的多酚類化合物，多存在于葡萄和紅酒中，具有抗氧化、抗炎、激活抗衰老酶 sirtuin 等多種藥理特性[12]。已有研究表明，白藜蘆醇能夠促進(jìn)葡萄糖攝取、提高肝糖耐受量和對(duì)胰島素的敏感性，可能的機(jī)制是白藜蘆醇激活 SIRT-1，通過(guò)影響機(jī)體代謝水平來(lái)發(fā)揮降血糖作用，也可能是通過(guò)抑制胰島 β 細(xì)胞 KATP通道或者激活 GLP-1 途徑以促進(jìn)胰島素分泌[12-15]，但其與 INGAP 的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道，那么，白藜蘆醇的抗糖尿病作用是否與上調(diào) INGAP 有關(guān)，我們將繼續(xù)進(jìn)行深入的研究。

綜上所述，本研究構(gòu)建了以 INGAP 啟動(dòng)子為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型，并篩選到了一個(gè)具有明顯上調(diào)作用的化合物白藜蘆醇。此模型的建立對(duì)探討基于 INGAP 藥物的分子作用機(jī)制以及探索開發(fā)新型糖尿病治療藥物都具有重要的意義。

[1] Al-Baharna MM, Whitford DL. Clinical audit of diabetes care in the bahrain defence forces hospital. Sultan Qaboos Univ Med J, 2013, 13(4):520-526.

[2] Bell GI, Polonsky KS. Diabetes mellitus and genetically programmed defects in beta-cell function. Nature, 2001, 414(6865):788-791.

[3] Pittenger GL, Taylor-Fishwick D, Vinik AI. The role of islet neogeneis-associated protein (INGAP) in pancreatic islet neogenesis. Curr Protein Pept Sci, 2009, 10(1):37-45.

[4] Lee CS, De León DD, Kaestner KH, et al. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3. Diabetes, 2006, 55(2):269-272.

[5] Lipsett M, Hanley S, Castellarin M, et al. The role of islet neogenesis-associated protein (INGAP) in islet neogenesis. Cell Biochem Biophys, 2007, 48(2-3):127-137.

[6] Borelli MI, Del Zotto H, Flores LE, et al. Transcription, expression and tissue binding in vivo of INGAP and INGAP-related peptide in normal hamsters. Regul Pept, 2007, 140(3):192-197.

[7] Dungan KM, Buse JB, Ratner RE. Effects of therapy in type 1 and type 2 diabetes mellitus with a peptide derived from islet neogenesis associated protein (INGAP). Diabetes Metab Res Rev, 2009, 25(6): 558-565.

[8] Taylor-Fishwick DA, Rittman S, Kendall H, et al. Cloning genomic INGAP: a Reg-related family member with distinct transcriptional regulation sites. Biochim Biophys Acta, 2003, 1638(1):83-89.

[9] Taylor-Fishwick DA, Shi W, Pittenger GL, et al. PDX-1 can repress stimulus-induced activation of the INGAP promoter. J Endocrinol, 2006, 188(3):611-621.

[10] Taylor-Fishwick DA, Shi W, Hughes L, et al. Pdx-1 regulation of the INGAP promoter involves sequestration of NeuroD into a non-DNA-binding complex. Pancreas, 2010, 39(1):64-70.

[11] Alcaraz-Pérez F, Mulero V, Cayuela ML. Application of the dual-luciferase reporter assay to the analysis of promoter activity in Zebrafish embryos. BMC Biotechnol, 2008, 8:81.

[12] Yu W, Fu YC, Wang W. Cellular and molecular effects of resveratrol in health and disease. J Cell Biochem, 2012, 113(3):752-759.

[13] Pollack RM, Crandall JP. Resveratrol: therapeutic potential for improving cardiometabolic health. Am J Hypertens, 2013 Sep 11. [Epub ahead of print]

[14] Timmers S, Hesselink MK, Schrauwen P. Therapeutic potential of resveratrol in obesity and type 2 diabetes: new avenues for health benefits? Ann N Y Acad Sci, 2013, 1290:83-89.

[15] Jimenez-Gomez Y, Mattison JA, Pearson KJ, et al. Resveratrol improves adipose insulin signaling and reduces the inflammatory response in adipose tissue of rhesus monkeys on high-fat, high-sugar diet. Cell Metab, 2013, 18(4):533-545.

Establishment and preliminary application of a screening model for identifying up-regulators of INGAP expression

ZHANG Xu-meng, WANG Lin-lin, REN Hao, HE Qi-yang, CHEN Ru-xian, XIE Yun-ying

To establish a screening model for identifying up-regulators of INGAP expression and screen active compounds.

Syrian golden hamster genome was used as template to amplify the core promoter sequence of INGAP. Then the obtained promoter fragment was cloned into pGL4.17 vector to construct the recombinant plasmid which subsequently was co-transfected into HIT-T15 cell line together with the internal reference plasmid pRL-TK using Lipofectamine 2000. The luciferase activity was detected using dual-luciferase reporter assay system in 96-well format. After optimizing the conditions of transient transfection, PMA was used as positive control to assess the validation of the model. The compounds in the library of our institute were then screened.

The recombinant plasmid named pGL4.17-INGAP was constructed and successfully transfected into HIT-T15 cell strain. The model was evaluated by positive control after optimization, and Z' factor is 0.57, showing that the model was able to use for screening up-regulators. Among the screened compounds, resveratrol showed up-regulated activity with EC50value of 1.6 μg/ml.

The cellular screening model for identifying up-regulators of INGAP expression was established.

Transcription initiation site; Drug evaluation, preclinical; Islet neogenesis associated protein

XIE Yun-ying, Email: xieyy@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.003

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81072556）；十二五“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301-002-001-018）

解云英，Email：xieyy@imb.pumc.edu.cn

2013-12-03

Author Affiliation: Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China